大豆幼苗根系抗氧化酶活性的耐酸、鋁研究＊

劉 鵬， 俞慧娜， 吳玉環(huán)， 徐根娣， 鄭艷萍， 周 菁

(1．浙江師范大學(xué)植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江金華 321004;2．杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州330036)

在我國，酸性土壤為紅壤，且面積較大．近年來，隨著酸雨的頻繁發(fā)生以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生理酸性肥料的大量施用，使得土壤的酸化進(jìn)一步加劇，土壤的富鋁化作用加強(qiáng)，鋁毒害成為酸性土壤或酸化土壤上作物生長最重要的限制因素［1］．土壤pH的變化對植物生長影響的研究報(bào)道不多［2-3］．因此，了解酸、鋁對植物的毒害對研究植物的耐鋁性具有重要的理論和實(shí)踐意義．鋁的溶解性在很大程度上取決于土壤pH，因此，維持植物根際周圍高pH值就能降低鋁的溶解性，從而減輕鋁毒害．有研究［4-6］指出，在相同pH下，改變?nèi)芤旱匿X濃度可以使植物根系生長受到更明顯的抑制，根系活力和根系質(zhì)膜透性也相應(yīng)地受到影響．

大豆是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，研究其生產(chǎn)中對鋁脅迫的防治具有重要的經(jīng)濟(jì)意義．目前有關(guān)金屬離子脅迫對大豆抗氧化酶影響的研究報(bào)道比較多見，如:俞慧娜等［7］研究表明，一定濃度的錳可以提高大豆體內(nèi)活性氧的清除和抗逆能力;鄭世英等［8］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在低濃度的Cd2+脅迫下，野生大豆與栽培大豆幼苗葉片的3種抗氧化酶:過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)均高于對照組;徐心誠［9］的研究說明高濃度鉛降低了大豆幼苗中SOD的活性，對大豆的生長有抑制作用;王啟明［10］則對鉻脅迫下大豆抗氧化酶活性的變化進(jìn)行了探究．

關(guān)于鋁對作物抗氧化酶活性影響的研究已開展了不少的工作，如對茶樹［11］、小麥［12］、薺菜［13］，以及部分野生草本植物等都已有相關(guān)報(bào)道［14］．而通過不同酸、鋁處理的探究工作較少見．李朝蘇等［15］通過測試與鋁脅迫直接有關(guān)的5個(gè)生理指標(biāo)，研究了蕎麥對酸、鋁脅迫的生理響應(yīng);朱佳等［16］進(jìn)一步報(bào)道了酸、鋁處理對蕎麥根系形態(tài)和體內(nèi)抗氧化酶的影響．Boscolo等［17］通過對玉米不同酸、鋁處理，探究了玉米葉片中 POD，CAT和SOD活性的變化情況．以大豆為研究對象，目前的研究工作主要集中在不同濃度的鋁處理?xiàng)l件下的探究，如劉鵬等［18］報(bào)道了不同濃度鋁處理對大豆幼苗膜脂過氧化和體內(nèi)保護(hù)系統(tǒng)的影響．而關(guān)于不同酸、鋁處理下大豆根系抗氧化酶系統(tǒng)活性變化的相關(guān)研究報(bào)道較少．本文采用水培實(shí)驗(yàn)法，以2個(gè)大豆品種(浙春2號和029-289)為材料，通過不同濃度酸、鋁處理，研究了大豆根系的抗氧化物酶活性的變化，旨在為大豆的耐酸、鋁機(jī)理深入研究提供資料．

1 材料和方法

1．1 材料與處理

以鋁耐性品種浙春2號和敏感性品種029-289為材料進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)．選大小一致、健康飽滿的種子放入消毒過的砂土中萌發(fā)，當(dāng)幼苗長至第1片真葉完全展開時(shí)，將其移入30 L的塑料箱中用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每5 d更換1次營養(yǎng)液，用氣泵每天2次通氣，每次2 h．在營養(yǎng)液中培養(yǎng)到3小葉完全展開后，挑選根系長勢基本一致的大豆幼苗，移入0．5 mmol·L-1CaCl2溶液中適應(yīng)(又稱洗根)12 h(黑暗條件下)，設(shè)置不同量的酸、鋁 (T1:0 mmol· L-1Al+pH 3;T2:0 mmol·L-1Al+pH 4;T3:0 mmol·L-1Al+pH 5;T4:0．5 mmol·L-1(13．5 mg·L-1)Al+pH 5;T5:1 mmol·L-1(27mg· L-1)Al+pH 5;T6:1 mmol·L-1Al+pH 3)處理2，4，6，12 和24 h 后，對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定，用0．1 mol·L-1HCl溶液和0．1 mol·L-1NaOH溶液每2 h調(diào)節(jié)1次pH值．

1．2 測定方法

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法［19］，用mg·g-1表示;SOD活性采用氮藍(lán)四唑光化學(xué)還原法(NBT)測定［19］，用 U·mg-1表示;POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法［19］，以每 min內(nèi) A470變化0．01為1個(gè)酶活性單位;CAT活性的測定采用硫代硫酸鈉滴定法［19］，以1 min酶解1 mg H2O2為1個(gè)活力單位，用U·mg-1表示．每個(gè)處理重復(fù)3次．

2 結(jié)果與分析

2．1 酸、鋁對大豆根系可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖1可知:隨著酸、鋁處理時(shí)間的增加，大豆根系可溶性蛋白質(zhì)含量總體上呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，在6 h時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸減少，在24 h時(shí)達(dá)到最小值;無鋁(T1～T3)影響下，隨著pH值的升高，可溶性蛋白質(zhì)含量先增多后減少，在T2處理下達(dá)到最大值，說明適當(dāng)提高pH值可以增加大豆根系的可溶性蛋白質(zhì)含量;在pH 5條件下，隨著Al3+濃度的增加(T3～T5)，大豆根系的可溶性蛋白質(zhì)含量仍然先增加后減小，在0．5 mmol·L-1Al處理下達(dá)到最大;T6處理下大豆根系可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到各酸、鋁處理下的最小值．

圖1 酸、鋁處理對浙春2號和029-289大豆根系可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

2．2 酸、鋁對大豆根系SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)的主要功能是催化超氧化物陰離子自由基O·-2發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，從而清除O·-2．因此，SOD活性是衡量植物受逆境脅迫大小的一個(gè)生理指標(biāo)．由圖2可以發(fā)現(xiàn):隨著處理時(shí)間的增加，大豆根系的SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢，在6 h時(shí)達(dá)到最大值，之后又逐漸下降，在24 h時(shí)達(dá)到最小值;在無鋁(T1～T3)影響下，隨著pH值的升高，SOD活性先升高后降低，在T2處理下達(dá)到最大值;在pH 5條件下，隨著Al3+濃度的增加(T3～T5)，大豆根系的SOD活性發(fā)生變化，在T4處理下出現(xiàn)最大值，隨后逐漸下降;T6處理下大豆根系SOD活性達(dá)到各酸、鋁處理下的最小值，說明對大豆根系的傷害達(dá)到最大．

圖2 酸、鋁處理對浙春2號和029-289大豆根系超氧化物歧化酶活性的影響

2．3 酸、鋁對大豆根系POD活性的影響

由圖3可知:隨著酸、鋁處理時(shí)間的增加，大豆根系的過氧化物酶(POD)活性先上升后下降，在6 h時(shí)達(dá)到最大值，之后又逐漸下降，在24 h時(shí)達(dá)到最小值;在無鋁(T1～T3)影響下，隨著pH值的升高，POD活性先升高后降低，在T2處理下達(dá)到最大值;在pH 5條件下，隨著Al3+濃度的增加(T3～T5)，POD活性逐漸增加(029-289在6 h時(shí)除外);T6處理下大豆根系POD活性達(dá)到酸、鋁處理下的最小值，說明對大豆根系的傷害最大．

圖3 酸、鋁處理對浙春2號和029-289大豆根系過氧化物酶活性的影響

2．4 酸、鋁對大豆根系CAT活性的影響

過氧化氫酶(CAT)活性的變化與POD活性的變化大體相似．由圖4可以發(fā)現(xiàn):隨著處理時(shí)間的增加，CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，都在6 h時(shí)達(dá)到最大值，之后又逐漸下降，在24 h時(shí)達(dá)到最小值;在無鋁(T1～T3)影響下，隨著pH值的升高，CAT活性先升高后降低，在T2處理下達(dá)到最大值;在pH 5條件下，隨著Al3+濃度的增加(T3～T5)，大豆根系的CAT活性逐漸增加(029-289在4 h時(shí)和浙春2號在4 h和6 h時(shí)除外)．T6處理下大豆根系的CAT活性達(dá)到各酸、鋁處理下的最小值，說明對大豆根系的傷害達(dá)到最大，對植物的生長造成脅迫．

圖4 酸、鋁處理對浙春2號和029-289大豆根系過氧化氫酶活性的影響

3 討論

鋁是土壤中含量最多的金屬元素，約占地殼總質(zhì)量的8%．在近中性土壤中，鋁不會(huì)對植物造成傷害，但在酸性環(huán)境中毒性較大的活性鋁便會(huì)從土壤中析出，對植物造成危害．酸性土壤中作物產(chǎn)量的下降和森林的毀滅都和鋁毒害有直接關(guān)系［20］．土壤中鋁的形態(tài)受pH的影響，隨著土壤的酸化，引起土壤中鹽基離子的淋失，促進(jìn)活性鋁的釋放．一般認(rèn)為pH＜5．5時(shí)就有活性鋁釋出．在pH 4．0～ 5．5，鋁 主 要 以 羥 基 鋁 如 Al(OH)2+，Al(OH)2+的形式存在;在pH 4．0以下，鋁主要以Al3+形式存在．鋁毒害已經(jīng)成為生長在酸性土壤中植物的主要限制因素［21］．因此，研究酸、鋁對植物的作用具有實(shí)踐意義．

鋁對作物的毒害是通過根部將土壤溶液中的活性鋁吸收到植物體內(nèi)產(chǎn)生的．所以抑制根的生長是鋁脅迫下植物出現(xiàn)的最早癥狀，這個(gè)癥狀對植物的影響以小時(shí)(h)變化，甚至在μmol/L鋁濃度下以分(min)變化［22］．有研究表明，pH對大豆鮮質(zhì)量的影響在pH 3．5 ～4．5抑制程度大，pH ＞4．5 時(shí)抑制程度小，隨著pH下降，其根系生長受到抑制，雖未達(dá)到顯著性差異水平，但還是對植物的生長造成了阻礙［6］．也有研究［23］認(rèn)為，在 pH ＞4 時(shí)，H+對根的傷害可以忽略．

關(guān)于鋁對植物根系的抑制時(shí)間問題一直以來都有不同的報(bào)道［20-21，24-28］，不同的作物對鋁的反應(yīng)時(shí)間有差異．本實(shí)驗(yàn)表明在酸、鋁處理2 h后就可對大豆根系的抗氧化酶系統(tǒng)有作用．造成植物根系鋁反應(yīng)時(shí)間不同的原因，可能是由于植物鋁耐性的不同導(dǎo)致植物對鋁的敏感性不同，也有可能與鋁的處理濃度有關(guān)．本實(shí)驗(yàn)中隨著酸、鋁處理時(shí)間的增加，大豆根系抗氧化酶活性和蛋白質(zhì)含量都呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，浙春2號和029-289兩個(gè)品種都在6 h時(shí)達(dá)到最大值，之后又逐漸下降，在24 h時(shí)達(dá)到最小值．

鋁對大豆抗氧化酶系統(tǒng)影響的研究大都停留在對植物葉片和單一鋁作用下的研究，在酸性條件下對大豆根系的研究還未見報(bào)道．本研究中，隨著pH由高到低，酸性逐漸增強(qiáng)，大豆根系蛋白質(zhì)含量、抗氧化酶系統(tǒng)的活性都是先升高后下降，在T2處理時(shí)達(dá)到最高值．一定的酸處理能增加植物蛋白質(zhì)含量，這可能是大豆對酸脅迫逆境的一種適應(yīng)性表現(xiàn)．大豆根部的SOD活性誘導(dǎo)升高，以清除脅迫時(shí)植物體內(nèi)的過量O2．-，這是植物的一種應(yīng)激反應(yīng)．隨后SOD活性下降，表明該酶歧化O2．-的能力下降，導(dǎo)致組織中的O2．-積累．CAT是廣泛分布于植物組織中的細(xì)胞內(nèi)H2O2的重要清除劑．本研究中大豆根系的CAT活性在T1處理下低于T3，表明清除H2O2的能力下降，將造成H2O2積累［29］．細(xì)胞內(nèi)H2O2不能及時(shí)清除，可與過量的O-2生成毒性更強(qiáng)的—OH．活性氧可直接攻擊生物大分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂、DNA分子結(jié)構(gòu)異常，使SOD和CAT等酶活性降低、細(xì)胞生理功能紊亂．POD對多種脅迫具有響應(yīng)，能降解H2O2，參與植物細(xì)胞木質(zhì)素合成、吲哚乙酸(IAA)降解［24，30］，在植物根組織中活性較高．本研究中，T2處理下大豆根系的POD活性有所增加，使組織清除H2O2的能力有所增強(qiáng)．

SOD對酸、鋁脅迫的種間敏感性順序?yàn)?29-289＞浙春2號．POD和CAT的活性對Al脅迫均表現(xiàn)為先升后降，POD的種間敏感性順序?yàn)檎愦?號＞029-289;高濃度Al對CAT具有明顯的抑制效應(yīng)，CAT對Al脅迫的種間敏感性順序?yàn)檎愦?號＞029-289．在酸、鋁長時(shí)間脅迫下，SOD對2種大豆體內(nèi)活性氧的清除起到關(guān)鍵作用，可作為大豆抗鋁能力強(qiáng)弱的敏感生理指標(biāo)，2種大豆中浙春2號的抗鋁能力最強(qiáng)，029-289次之．

在脅迫強(qiáng)度較輕、脅迫時(shí)間較短、脅迫速度緩慢時(shí)，SOD，CAT和POD的活性上升;在脅迫強(qiáng)度較大、脅迫時(shí)間較長、脅迫速度快時(shí)，SOD和CAT的活性下降．雙重脅迫下，導(dǎo)致SOD活性始終呈現(xiàn)下降趨勢，而CAT和POD的活性上升;CAT活性表現(xiàn)出雙峰變化或前期上升、后期下降的趨勢，此結(jié)果與盧少云等［31］的研究相同．

鋁的溶解性在很大程度上取決于土壤pH，因此，維持植物根際周圍高pH就能降低鋁的溶解性，從而減輕鋁毒害．本實(shí)驗(yàn)在pH 5條件下研究了不同濃度鋁對大豆抗氧化酶活性的影響．可以看出，酸、鋁對大豆根系抗氧化酶活性的影響不同:隨著鋁濃度的升高，蛋白質(zhì)含量和SOD活性先升高后下降，在T4處理下達(dá)到最大值，而POD和CAT活性則逐漸升高．表明大豆根系可以在鋁脅迫下通過POD活性升高與其他抗氧化酶一起來清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，以減輕Al對植物的傷害．POD和CAT作為植物體內(nèi)H2O2的清除劑［32］，隨著酸、鋁處理時(shí)間的增加，POD和CAT的活性隨著鋁濃度的變化逐漸上升，表明在酸、鋁處理下大豆根系對H2O2的清除效果較好．把T1和T6處理相比，可以看出，相同pH條件下改變鋁濃度，可以使大豆根系抗氧化酶系統(tǒng)受到更明顯的抑制，總蛋白質(zhì)含量也相應(yīng)地受到影響，2個(gè)大豆品種都受到了最大的傷害．細(xì)胞受到氧化脅迫，由此引起的氧化損傷能夠使植物的生理代謝紊亂、生長發(fā)育異常．

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