氧化還原因子-1的原核表達(dá)純化及其活性鑒定*

丁正中， 張 璐， 李 濤

(1．浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004;2．艾青中學(xué)，浙江金華 321015)

氧化還原因子-1(Ref-1)是哺乳動物細(xì)胞中重要的雙功能蛋白，在DNA損傷修復(fù)及抗氧化防御屏障中發(fā)揮著關(guān)鍵作用．Ref-1由318個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約為37 kD，包含2個主要功能域．Ref-1的C端功能區(qū)進(jìn)化高度保守，約157個氨基酸，具有核酸內(nèi)切酶活性．離子輻射、活性氧(radical oxygen substrates，ROS)和烷化劑等可引起DNA損傷，造成脫嘌呤/脫嘧啶位點(apurinic/apyrimidinic sites，AP 位點)．Ref-1是 AP 位點堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)途徑中主要的限速酶［1］．如果Ref-1的這一功能缺陷，將造成AP位點累積，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡．放射治療、烷化劑及核苷酸類似物藥物(如:博萊霉素、替莫唑胺、吉西他濱等)均可顯著增強(qiáng)Ref-1蛋白表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥，最終導(dǎo)致藥物失敏的重要機(jī)制［2-4］．

Ref-1獨特的親水性N末端由約127個氨基酸組成，種屬差異較大，該段序列賦予Ref-1氧化還原酶活性．氧化損傷造成半胱氨酸巰基發(fā)生二硫鍵交聯(lián)、S-硝基化、谷胱甘肽化．通過還原半胱氨酸殘基，Ref-1能回復(fù)氧化損傷蛋白的功能活性．Ref-1能顯著促進(jìn)許多轉(zhuǎn)錄因子的激活并提高它們的DNA結(jié)合能力，這代表了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中一種新型的氧化還原調(diào)控模式，對真核基因表達(dá)意義重大［5］．氧化應(yīng)激條件下，Ref-1表達(dá)增高或磷酸化活化，引起參與氧化還原調(diào)節(jié)的激活蛋白-1(AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子活性變化，進(jìn)而引起下游靶基因的活化，使一些對細(xì)胞具有保護(hù)作用的蛋白得到表達(dá)．因此，抑制Ref-1氧化還原酶活性，亦能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤增殖．

Ref-1的高表達(dá)、活性增高及亞細(xì)胞定位改變與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，并關(guān)系到腫瘤的惡性程度以及放化療的敏感性［6-8］．如何抑制Ref-1的表達(dá)或活性，是目前腫瘤靶向治療的重要課題．本實驗通過原核表達(dá)純化人源Ref-1蛋白，建立了其活性檢測體系，為進(jìn)一步研究Ref-1蛋白的功能、篩選Ref-1特異性抑制劑建立前期基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 材料

菌株BL21(DE3)和質(zhì)粒pGEX-4T-3為浙江師范大學(xué)動物生理實驗室保存．pRc/RSV-Ref-1質(zhì)粒由日本名古屋大學(xué)Fukushi Kambe教授惠贈．

1．2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

HindⅢ和XbaⅠ雙酶切將Ref-1編碼片段從pRC/RSV真核表達(dá)載體中釋放出來，插入pBluesciptⅡ SK(+)相應(yīng)位點．pBluesciptⅡSK(+)/Ref-1質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切釋放Ref-1編碼片段，插入pGEX-4T-3相應(yīng)位點，完成Ref-1原核表達(dá)載體的構(gòu)建．挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定，并由北京奧科公司測序，確定基因正確插入且無突變．

1．3 GST-Ref-1融合蛋白的表達(dá)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌BL21，挑克隆，在含氨芐西林(Amp)的LB培養(yǎng)基上搖菌過夜．將50 mL培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)至1 000 mL LB培養(yǎng)液中220 r/min培養(yǎng)2～4 h，使 A600=0．6，降低溫度至30℃，加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0．4 mmol/L，搖菌4～6 h．收集菌液，每1 000 mL細(xì)菌用40 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，冰上超聲直至液體不再混濁，4℃，14 000 r/min離心20 min，收集上清液．分別取誘導(dǎo)前后的培養(yǎng)液及超聲離心后的上清液和沉淀，加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，分析融合蛋白的表達(dá)情況．

1．4 GST-Ref-1融合蛋白的純化

加1 mL 50%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B(Glutathione Sepharose 4B)溶液至超聲后的上清液中，室溫下垂直混懸器混懸結(jié)合過夜，4℃，500 r/min離心5 min后，收集珠子，預(yù)冷的1 mL磷酸鹽緩沖液洗5遍，離心后收集珠子，加1 mL 10 mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液，垂直混懸器輕輕混懸20 min，4 ℃，500 r/min離心5 min，吸出上清液置新管中．再重復(fù)洗滌3次，分別收集上清液．

將上清液收集入透析袋，4℃透析3次，每4 h更換透析液(PBS)，聚乙二醇8000(PEG8000)濃縮至1 mL，加入終含量為10%的甘油，含0．5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，－80℃保存．純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色檢測條帶．谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)按上述方法表達(dá)純化．

1．5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)

分別取10 μL純化的GST-Ref-1及GST進(jìn)行SDS-PAGE分析，濕式電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)膜．以兔源Ref-1抗體為一抗，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔抗體為二抗，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑盒顯影曝光，鑒定表達(dá)產(chǎn)物．

1．6 GST-Ref-1氧化還原酶活性的檢測

應(yīng)用凝膠阻滯法檢測GST-Ref-1氧化還原酶活性．按文獻(xiàn)方法提取HeLa細(xì)胞核蛋白，建立體外反應(yīng)體系［9-10］．北京奧科公司合成轉(zhuǎn)錄因子AP-1特異識別的雙鏈探針，正鏈序列為5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3'．T4多聚核苷酸激酶對探針進(jìn)行末端32P標(biāo)記．在每組反應(yīng)混合物中，核蛋白用量為40 μg，GST-Ref-1的用量是400 ng．核蛋白與GST-Ref-1體外混勻后，用終濃度為20 mmol/L的H2O24℃處理15 min后，用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示AP-1蛋白與探針DNA結(jié)合條帶．

2 結(jié)果與分析

圖1 質(zhì)粒酶切鑒定圖

2．1 Ref-1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

Ref-1原核表達(dá)載體的構(gòu)建流程如下:首先，用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切將Ref-1編碼片段從測序正確的pRC/RSV真核表達(dá)載體中釋放出來，之后將Ref-1編碼片段插入pBluesciptⅡ SK(+)相應(yīng)位點，經(jīng)鑒定2－4泳道的克隆均為正確插入目的基因的重組質(zhì)粒(見圖 1(a));接著，用SalⅠ和NotⅠ雙酶切釋放約1 kb的Ref-1編碼片段，插入pGEX-4T-3相應(yīng)位點，從而完成GSTRef-1原核表達(dá)載體的構(gòu)建，經(jīng)鑒定8泳道的克隆為目的重組質(zhì)粒(見圖1(b))．圖1中酶切出現(xiàn)1 kb左右的條帶，說明獲得了Ref-1編碼片段．測序結(jié)果表明，pGEX-4T-3/Ref-1質(zhì)粒構(gòu)建正確，讀碼框無移碼，無堿基錯配．

2．2 GST-Ref-1融合蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)

將pGEX-4T-3/Ref-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)外源基因．為了能夠檢測融合蛋白的表達(dá)效率及其可溶性，分別取誘導(dǎo)前后的菌體及裂菌后的上清液、沉淀，同時進(jìn)行SDSPAGE，對凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，分析蛋白條帶．如圖2所示，GST-Ref-1蛋白得到了有效的表達(dá)，2號孔為誘導(dǎo)后蛋白電泳條帶，在65 kD左右出現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)條帶，符合理論預(yù)期．并且，GSTRef-1蛋白的表達(dá)性質(zhì)基本為可溶性表達(dá)，3號孔為上清液樣品，可發(fā)現(xiàn)其中含有大量的GST-Ref-1融合蛋白．這些證據(jù)表明GST-Ref-1原核表達(dá)成功，并且基本為可溶性表達(dá)，極有利于下一步的純化操作及后續(xù)研究．

圖2 GST-Ref-1融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)圖

2．3 GST-Ref-1融合蛋白的親和純化

采用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子親和富集GST-Ref-1融合蛋白，再用10 mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫GST-Ref-1融合蛋白，分別流洗4次，每個批次的洗脫液取10 μL做SDS-PAGE染色，如圖3所示，GST-Ref-1融合蛋白得到了有效的親和純化，并以第2次流洗的效率最高．Science lab軟件灰度掃描，得出純化蛋白的純度為92%．對純化的GST-Ref-1融合蛋白進(jìn)行透析去除谷胱甘肽，PEG8000濃縮后加甘油凍存于－80℃冰箱中．

圖3 GST-Ref-1融合蛋白親和純化后產(chǎn)物的電泳圖

為了計算融合蛋白的誘導(dǎo)效率及親和純化的蛋白得率，實驗中對每次保留的蛋白都進(jìn)行了BCA法蛋白定量．首先通過Science lab軟件灰度掃描分析，得出誘導(dǎo)后GST-Ref-1融合蛋白占菌體蛋白的比率為21．5%．再經(jīng)BCA法蛋白定量，得出經(jīng)親和純化濃縮后的GST-Ref-1融合蛋白占誘導(dǎo)后原始菌體的比率為6．8%，占超聲裂解后上清液中蛋白的比率為11．7%．

2．4 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測

蛋白質(zhì)印跡檢測驗證GST融合蛋白是否為表達(dá)序列正確的Ref-1蛋白．如圖4所示，只有GST-Ref-1條帶位置能檢測到強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信號，而對照GST條帶無發(fā)光信號．表明GST-Ref-1原核表達(dá)質(zhì)粒能夠正確表達(dá)Ref-1融合蛋白，具有良好的抗原性．

圖4 GST-Ref-1融合蛋白純化終產(chǎn)物PAGE考馬斯亮藍(lán)染色及蛋白質(zhì)印跡檢測

2．5 GST-Ref-1蛋白活性的檢測

許多轉(zhuǎn)錄因子受到Ref-1氧化還原調(diào)控，如AP-1，NFκB，CREB，ATF，NF-Y 和 p53 等，Ref-1 能直接增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力．為了驗證GST-Ref-1融合蛋白是否具備活性，通過凝膠阻滯實驗對其氧化還原酶活性進(jìn)行了檢測．結(jié)果如圖5所示:GST-Ref-1直接增強(qiáng)了AP-1與靶DNA的結(jié)合量，而GST蛋白本身對AP-1的DNA結(jié)合能力無影響，表明GST-Ref-1融合蛋白能增強(qiáng)AP-1的DNA結(jié)合能力;同時，H2O2抑制了AP-1與探針的結(jié)合，但同時加入GST-Ref-1蛋白能部分恢復(fù)AP-1的DNA結(jié)合活性．表明GST-Ref-1融合蛋白具有氧化酶活性．

圖5 凝膠阻滯法檢測GST-Ref-1融合蛋白氧化還原酶活性

3 討論

本實驗采用pGEX-4T-3載體系統(tǒng)，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了GST-Ref-1融合蛋白的可溶性表達(dá)，并進(jìn)行了親和純化，蛋白在菌體中未出現(xiàn)明顯的降解．該系統(tǒng)有利于GST-Ref-1融合蛋白的可溶性表達(dá)與親和純化，純化條件溫和、步驟簡單，同時能極大限度地保持融合蛋白的空間結(jié)構(gòu)和免疫原性，有利于下一步實驗操作．本實驗所獲得的GST-Ref-1融合蛋白，可用于抗體制備，利用GST pull-down實驗揭示 Ref-1互作蛋白，篩選Ref-1蛋白抑制劑．

Ref-1是重要的抗氧化基因，亦是重要的腫瘤耐藥基因．Ref-1具有AP內(nèi)切酶活性，可修復(fù)放射、烷化劑、氧化應(yīng)激造成的DNA損傷;同時其所具有的氧化還原酶活性能調(diào)控大量轉(zhuǎn)錄因子的活性，上調(diào) Bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)．Robertson等［11］首先發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌、睪丸癌中Ref-1過表達(dá)可增強(qiáng)其對博來霉素和射線的抵抗．Fishel等［12］研究發(fā)現(xiàn)，Ref-1在卵巢腫瘤中高表達(dá)，如利用siRNA技術(shù)將其沉默掉，腫瘤體積明顯縮小，細(xì)胞增殖減慢，阻滯于細(xì)胞周期S期．王東研究組［13］構(gòu)建了Ref-1的RNAi質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系9901，發(fā)現(xiàn)抑制Ref-1表達(dá)能夠下調(diào)血管來源的生長因子(VEGF)表達(dá)，抑制腫瘤微血管的形成，同時提高了骨肉瘤細(xì)胞放療的敏感性．Ref-1還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性．近期研究發(fā)現(xiàn)，Ref-1調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子 YB-1，從而誘導(dǎo)多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)［14］．MDR1基因編碼跨膜蛋白 P-糖蛋白，P-糖蛋白為藥物泵，通過三磷酸腺苷(ATP)提供能量，可將藥物泵出細(xì)胞外，使其細(xì)胞毒作用減弱直至喪失，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象．因此，Ref-1是腫瘤治療的重要靶向分子．

研究者開發(fā)了多種藥物試圖封閉Ref-1的表達(dá)或活性［15-17］．第1類為AP內(nèi)切酶活性抑制劑，主要有7-硝基吲哚-2-甲酸、CRT0044876、硫蒽酮和甲氧胺;第2類為氧化還原酶活性抑制劑，如E3330和白藜蘆醇，此類抑制劑往往同時抑制活性氧通路及NFκB的活化，效應(yīng)相對較廣;第3類則是能夠抑制Ref-1表達(dá)的化學(xué)物質(zhì)，如大豆異黃酮．

本實驗表達(dá)的GST-Ref-1融合蛋白，經(jīng)體外凝膠阻滯實驗發(fā)現(xiàn)具有氧化酶活性，能直接增強(qiáng)AP-1的DNA結(jié)合能力，并能抑制H2O2對AP-1蛋白的損傷．如何構(gòu)建合適的藥物篩選體系，檢驗藥物對Ref-1 AP內(nèi)切酶及氧化還原酶活性的影響，將是一個有意義的研究方向．

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