Cyclin D1在膀胱癌中的表達及意義

曾文利

(武漢大學人民醫(yī)院泌尿Ⅱ外科 湖北 430060)

Cyclin D1在膀胱癌中的表達及意義

曾文利

(武漢大學人民醫(yī)院泌尿Ⅱ外科 湖北 430060)

目的 探討細胞因子CyclinD1在膀胱癌中的表達及臨床意義。方法 收集武漢大學人民醫(yī)院病理科2000-2006年有完整臨床和病理資料的膀胱癌存檔蠟塊50例和5例癌旁組織,采用免疫組織化學S-P法檢測50例膀胱癌和5例癌旁組織中CyclinD1的表達水平,分析了CyclinD1與臨床分期,病理分級的關系。采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng),對CyclinD1的表達進行定量分析,并用SPSS13.0軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q)檢驗。結果 CyclinD1在膀胱癌中呈高表達,癌旁組織中呈低表達,差異有顯著性 (P<0.05)。圖像分析結果顯示:膀胱癌與癌旁組織之間,CyclinD1的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異(P<0.05),經統(tǒng)計學分析,CyclinD1表達與膀胱癌病理分級臨床分期無顯著性差異(P>0.05)。結論 CyclinD1在膀胱癌中的異常表達可能參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

膀胱癌; CyclinD1; 免疫組織化學

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,其發(fā)生率在男性腫瘤中已上升至第4位,在女性腫瘤中居第8位,其主要的病理類型是膀胱癌,約占90%以上[1]。STA T3是近年來研究異?；钴S的轉錄因子,參與調節(jié)細胞周期、增殖和凋亡,又被稱為癌基因[2]。CyclinD1是STA T3的一個下游靶基因,其作為細胞周期核因子,可使細胞由 G1期向S期轉變促進細胞增殖,是STA T3信號通路中的關鍵因子。本研究通過檢測CyclinD1在膀胱癌的表達,探討CyclinD1與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及臨床、病理的關系,以提高人們對膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制及膀胱癌生物學行為的認識。探討其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展機制中所起的作用。

材料和方法

1.材料

收集武漢大學人民醫(yī)院病理科2004-2006年病理學證實的膀胱癌病例50例,其中男性38例,女性12例,平均年齡50.3歲,另取5例癌旁組織做對照。標本均經HE染色,光鏡觀察診斷,按WHO病理分級標準,G1 30例,G2 15例,G3 5例;按UICC臨床分期,淺表性腫瘤(Tis-T1)31例,浸潤性腫瘤(T2-T4)19例。其中未經化療的初發(fā)腫瘤28例,化療后復發(fā)腫瘤22例。膀胱腫瘤病理分級與臨床分期見表1。

2方法

2.1 HE染色 常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片

2.2 主要試劑 即用型兔抗人CyclinD1多克隆抗體;(北京中杉生物技術有限公司);超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒;(北京中杉生物技術有限公司);DAB顯色試盒及多聚賴氨酸 (北京中杉生物技術有限公司)。

表1 膀胱腫瘤病理分級與臨床分期Table 1 Bladder tumor Pathological grade and clinical stage

2.3 免疫組織化學SP法檢測CyclinD1相關抗原:5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水后,行檸檬酸緩沖液微波抗原修復,滴加3%過氧化氫抑制內源性過氧化物酶活性,正常羊血清濕盒孵育減少非特異性背景;滴加一抗,4℃孵育過夜;滴加生物素標記的二抗,37℃濕盒孵育10min;DAB顯色,光鏡下控制反應時間;蘇木素復染;分色、返藍、脫水、透明,中性樹膠封片并鏡檢;用 PBS代替一抗作為陰性對照組,購買的陽性片作為CyclinD1的陽性對照組。

3結果判斷

3.1 CyclinD1以細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應,陰性對照組除細胞核染成藍色外,應無棕黃色反應產物。

3.2 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)(同濟千屏影像公司)對CyclinD1的表達進行定量分析,每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400),測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積,計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。(陽性面積率=單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積×100%)

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗,檢驗水準α為0.05。

結 果

1.CyclinD1的表達

癌旁組織細胞胞漿內可見少量的棕黃色顆粒,CyclinD1表達弱(圖1a);膀胱癌細胞胞漿內可見較多棕黃色顆粒,CyclinD1呈強陽性表達(圖1b)。圖像分析結果顯示:膀胱移行細胞癌的平均光密度為0.9851±0.0084;癌旁組織的平均光密度為0.2637±0.0037。膀胱癌的陽性面積率為 1.0658±0.0075;癌旁組織的陽性面積率為 0.2980±0.0046。經q檢驗,膀胱癌與癌旁組織之間,CyclinD1的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異(P<0.05)(表 1)。

表1 膀胱癌和癌旁組織Cyclin D1表達的平均光密度和陽性面積率(ˉx±s)Table 1 The average optical density and the rate of positive area of Cyclin D1 in transitional cell carcinoma of bladder and cancer side tissue(ˉx ±s)

2.CyclinD1在不同分化腫瘤中表達的比較(表2)。

CyclinDI在分化較好的腫瘤中表達高于分化差的腫瘤,統(tǒng)計學分析,P>0.05差異不顯著。

表2 CyclinD1在不同分化腫瘤中表達的比較Table 2 CyclinD1 expressed in different tumor differentiation comparison

圖1 a.CyclinD1表達弱(SP×200);b.膀胱癌CyclinD1的表達,膀胱癌細胞胞漿內可見較多棕黃色顆粒,CyclinD1呈強陽性表達(SP×200)Fig.1 a.the expression of CyclinD1 in cancer side tissue.There were few brown particles in the cytoplasm,which showed expressed weakly.S-P×200;b.the expression of CyclinD1 in transitional cell carcinoma of bladder.There were plenty of brown particles in the nuclear,which showed CyclinD1 expressed strongly(S-P×200)

討 論

CyclinD1是 G1/S期過渡檢查點的重要調控因子,通過刺激細胞周期素依賴性激酶4(cyclinD-dependent Kinase4,CDK4)介導 Rb基因蛋白產物的磷酸化,從而解除Rb對轉錄因子E2F的抑制效應,游離的 E2F進入核內結合一系列具有特殊序列的基因啟動區(qū),促進這些基因的轉錄,細胞將通過 G1→S調控點,進入自主分裂程序[3,4]。因此,cyclinD1的表達上調使細胞失控性生長。

cyclinD1是促進細胞周期進行的重要調節(jié)因子,許多腫瘤存在它們的表達異常。

細胞在生長因子外源性有絲分裂原的刺激下,CyclinD1mRNA和蛋白表達明顯增加,到 Gl期中部達高峰,Cyclin E在CyclinD1高峰后開始表達增加,于 G,/S轉折點處達峰值。CyclinD1、Cyclin E分別與CDK4、6和CD凡結合形成復合物發(fā)揮作用。CyclinD1過度表達,使細胞周期 Gl/s轉換時間縮短,進而促進細胞周期的進程和細胞過度增殖,導致細胞癌變。本實驗發(fā)現(xiàn)CyclinD1作為原癌基因,促增殖作用的細胞周期素,在分化較好增殖較少的高分化腫瘤中表達更多。以往研究表明,表達野生型PRb的正常細胞和腫瘤細胞和G1進展都需要有CyclinD1,而 PRb失活的細胞株中CyclinD1蛋白和mRNA水平都很低下,其功能也不為細胞周期進展所需要。也許正是由于Rb的表達缺少造成了高分級膀胱癌中CyclinD1的低表達率。高分級膀胱癌中活躍的細胞增殖可能還存在除CyclinD1之外的調控機制。CyclinD1過表達在膀胱癌組與癌旁組織比較差異顯著,與臨床分期無關。由此推測,CyclinD1過表達可能是膀胱癌發(fā)生過程的早期事件,CyclinD1可能是在以細胞增殖為必要步驟的始發(fā)階段發(fā)揮作用,不參與腫瘤的浸潤、轉移過程。

多項研究表明,cyclinD1為stat3信號轉導通路的下游靶基因。Amin等[5]在淋巴瘤細胞中選擇性抑制stat3活性可明顯促進細胞凋亡、導致細胞周期G1期的延長。Leslie等[6]研究證明stat3是通過其SH2結構域與v-Src結合,上調cyclinD1 mRNA和蛋白的表達,加快細胞增殖,介導細胞惡性轉化。STA T3作為一種關鍵性的細胞內信號轉導蛋白,主要通過酪氨酸磷酸化作用成為磷酸化STA T3單體,并形成二聚體轉移入核,調控下游靶基因的轉錄,在前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌等惡性腫瘤組織和細胞株中存在異常表達和活性增強,提示STA T3在癌腫發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[7,8]。本研究的結果也表明,CyclinD1在膀胱癌中呈高表達,癌旁組織中呈低表達,差異有顯著性 (P<0.05)。這些結果提示:cyclinD1在膀胱癌中異常高表達可能促進了腫瘤細胞周期循環(huán)加速和細胞持續(xù)異常增殖,推測cyclinD1在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展中起了一定的作用。

腫瘤的治療中,一個非常重要的問題是如何判斷腫瘤的生物學特性。目前還沒有合適的生物學指標可以準確的預測膀胱癌的發(fā)展和預后。cyclinD1在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用,有可能成為判斷膀胱癌生物學行為的重要指標。

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Expression of Cyclin D1 in bladder carcinoma and its signif icance

Zeng Wenli
(Department of Urology,Renmin Hospital of Wuhan university,Hubei 430060,china)

Objective To investigate the expression of CyclinD1 in bladder carcinoma and its clinical significance.Methods The paraffin blocks of 50 cases of bladder transitional cell carcinoma and 5 cases of adjacent tissues with a complete clinical and pathological data were collected f rom the department of pathology in Renmin Hospital of Wuhan University between 2000 and 2006.Immunohistochemical SP method was performed to detect CyclinD1 expression in the blocks.The relationship between CyclinD1 expression and clinical stage and pathological grade was analysed.HPIAS-1000 high resolution color graphic pathology report management system was used to analyze the quantitative analysis of CyclinD1.The single factor analysis of variance and SN K(q)test were applied to analyze the average optical density of positive particles and the positive area rate of immunohistochemical reaction of each group.Results CyclinD1 was highly expressed in bladder carcinoma but weakly expressed in adjacent tissues,and the difference was significant.Image analysis showed that the average optical density and the positive area rate of CyclinD1 was significantly different between bladder cancer and adjacent tissue(P<0.05).Statistical analysis showed that the expression of CyclinD1 had no significant difference between high and low differentiated groups(P>0.05).Conclusion Abnormal expression of CyclinD1 in bladder carcinoma may be involved in tumorigenesis and development.

Transitional cell carcinoma of bladder; CyclinD1; Immunohistochemistry

R735.2

A

10.3870/zgzzhx.2011.04.013

2011-03-10

2010-06-11

曾文利,女(1970年),漢族,碩士。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)