丁烯基多殺菌素高產(chǎn)菌株的選育和改造策略

王靖楠，龐建，秦磊，郭超，呂波，李春，，王超

（1 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院生物化工研究所醫(yī)藥分子科學(xué)與制劑工程工信部重點實驗室，北京 100081； 2 清華大學(xué)化學(xué)工程系生物化工研究所，北京 100084； 3 國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧油加工研究所，北京 100037）

引 言

蟲害對農(nóng)作物生產(chǎn)及糧食貯存危害極大，近年我國蟲害發(fā)病率逐年上升，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全造成嚴(yán)重威脅。目前我國主要通過化學(xué)農(nóng)藥控制蟲害，難以滿足綠色農(nóng)業(yè)要求，損害環(huán)境和人類健康，農(nóng)藥減量增效勢在必行，開發(fā)綠色安全高效的新型生物殺蟲劑成為保障我國農(nóng)業(yè)安全的迫切需求。

多殺菌素類生物殺蟲劑殺蟲譜廣且殘留低，在自然環(huán)境中主要被光降解，其在土壤、葉面、水中光降解半衰期分別為10 d、1.6 d、小于1 d[1]。丁烯基多殺菌素可殺滅多殺菌素難以控制的蘋果蠹蛾、煙青蟲、馬鈴薯甲蟲等害蟲，對靶標(biāo)昆蟲表現(xiàn)出攝食和觸殺毒性[2]，在生物農(nóng)藥領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，但其產(chǎn)量達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)要求。

丁烯基多殺菌素與多殺菌素結(jié)構(gòu)相似，其生產(chǎn)菌同屬于糖多孢菌屬，具有相近的親緣關(guān)系，本文借鑒了多殺菌素高產(chǎn)菌株的選育策略，從誘變選育及基因工程育種方面介紹了當(dāng)前可用于丁烯基多殺菌素高產(chǎn)菌株選育的方法。

1 丁烯基多殺菌素

1.1 丁烯基多殺菌素結(jié)構(gòu)及命名

丁烯基多殺菌素主要由三部分構(gòu)成，糖苷配基和兩側(cè)的糖基，糖基一般為福樂糖胺基團(tuán)和鼠李糖基團(tuán)，由于須糖多孢菌糖基轉(zhuǎn)移酶的雜泛性，使得丁烯基多殺菌素的C17位還可連接除福樂糖胺及其異構(gòu)體的其他中性基團(tuán)[3]。丁烯基多殺菌素與多殺菌素結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別為：①內(nèi)酯環(huán)可以是十四元大環(huán)；②C8 可被羥基化；③C17 可連接除福樂糖胺的其他中性糖；④C21 是丁烯基[3]。乙基多殺菌素（spinetoram）由多殺菌素（主要成分為spinosyn A 和spinosyn D，一般將二者合稱為spinosad）化學(xué)半合成而來。上述結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 丁烯基多殺菌素、多殺菌素、乙基多殺菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of butenyl-spinosyn,spinosyn and spinetoram

1.2 丁烯基多殺菌素生產(chǎn)菌株

1990 年研究者從美國印第安的土壤樣本中篩選獲得了菌株NRRL30141，其發(fā)酵產(chǎn)物中含30多種不同結(jié)構(gòu)的丁烯基多殺菌素，該菌株在電鏡下呈現(xiàn)明顯的毛刺特征，被命名為須糖多孢菌[3]，分類學(xué)上屬于：細(xì)菌界，放線菌門，放線菌綱，假諾卡氏菌目，假諾卡氏菌科，糖多孢菌屬[4]。郭超等[5]從中國浙江土壤中篩選到的SaccharopolysporaASAGF 58 可產(chǎn)丁烯基多殺菌素，該菌株具有生長速度快、營養(yǎng)需求簡單且產(chǎn)孢豐富的特點。

1.3 殺蟲機(jī)理

美國密歇根州立大學(xué)的節(jié)肢動物抗藥性數(shù)據(jù)庫（APRD）數(shù)據(jù)表明，30 種昆蟲已對多殺菌素產(chǎn)生抗性，6 種昆蟲對乙基多殺菌素產(chǎn)生抗性[6]。研究表明，多殺菌素通過與煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）和γ-氨基丁酸受體（GABARs）相互作用引起昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)快速興奮，昆蟲因肌肉震顫疲勞而死；關(guān)于GABARs 的機(jī)理尚不清晰，可能是多殺菌素與其結(jié)合影響了氯離子通道[7]?，F(xiàn)已在注釋的昆蟲基因組中發(fā)現(xiàn)了十多種nAChRs 亞基（圖2），這些亞基可以協(xié)同組裝成具有不同功能的同五聚體或異五聚體，不同的殺蟲劑對于亞基的結(jié)合選擇或結(jié)合位點不同，因此也造成了不同的殺蟲效果[8]。由于殺蟲劑過度使用，越來越多有害昆蟲對其產(chǎn)生了抗藥性，通過提高使用間隔期及交替使用無交叉抗性殺蟲劑可延緩抗藥性產(chǎn)生[9]。

圖2 nAChRs示意圖[8]Fig.2 Schematic diagram of nAChRs[8]

大部分研究認(rèn)為多殺菌素類物質(zhì)只對部分昆蟲具有毒性，對脊椎動物幾乎無影響。然而近期有研究表明：多殺菌素可對鼠、猴等哺乳動物產(chǎn)生細(xì)胞毒性[10]，乙基多殺菌素可抑制人肝細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)DNA 氧化損傷[11]，目前尚未見丁烯基多殺菌素對哺乳動物有毒性的報道。

2 誘變選育高產(chǎn)菌株

性能良好的菌株是實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的前提，為提高多殺菌素及其結(jié)構(gòu)類似物生產(chǎn)菌的性能，大量研究人員通過紫外（UV）誘變、60Co 輻射誘變等物理誘變方式及N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）誘變、亞硝基胍（NTG）誘變、甲基磺酸乙酯（EMS）誘變等化學(xué)誘變方式使菌株基因組產(chǎn)生大量的突變位點，一些新型誘變技術(shù)也被開發(fā)，如：常壓室溫等離子體（ARTP）誘變、多功能等離子體（MPMS）誘變、N+離子注入誘變、航空搭載育種、轉(zhuǎn)座誘變等。單一誘變方式的基因突變類型較少，增加突變概率的復(fù)合誘變方式可以很好地解決這一問題。此外，通過原生質(zhì)體融合使基因組重排來富集正向突變成效顯著（表1）。

表1 多殺菌素高產(chǎn)菌株的誘變選育方法Table 1 Mutation breeding method to high-yield strains of spinosyn

從基因組層面來看，誘變會為菌株基因帶來大量突變，包括插入、缺失和單核苷酸變異[25]，這些非理性變異經(jīng)過理性篩選即可能得到目標(biāo)性狀菌株。有研究者為探究誘變刺糖多孢菌提產(chǎn)多殺菌素的分子機(jī)制，將誘變得到的高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株做比較組學(xué)分析，均發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)菌株的碳代謝發(fā)生顯著變化。Zhang 等[26]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)菌株糖酵解途徑增強(qiáng)，丙酮酸脫氫酶表達(dá)量降低，脂肪酸β-氧化途徑、酮?；铣赏緩胶王；D(zhuǎn)運途徑上調(diào)。Zhao等[27]通過代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)菌株初級代謝明顯加強(qiáng)，乙酰輔酶A 顯著積累。Xia 等[28]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)誘變高產(chǎn)菌株初級代謝相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)量下降，與聚酮前體合成相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量上升。以上研究均證明了誘變產(chǎn)生的高產(chǎn)菌株具有大量的乙酰輔酶A 積累，為多殺菌素的合成提供足夠數(shù)量的?；绑w。

然而傳統(tǒng)誘變選育方法只以目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量為篩選目標(biāo)，篩選工作量大。常規(guī)的化學(xué)檢測法（高效液相色譜）[29]難以滿足龐大的篩選工作。研究者建立了以蚊子幼蟲致死率為靶標(biāo)的生物測定法[16]，結(jié)合96孔板發(fā)酵培養(yǎng)實現(xiàn)了高通量篩選；利用多殺菌素作為免疫原進(jìn)行抗體制備，建立了基于ELISA的高通量篩選技術(shù)[30-31]，但檢測結(jié)果易受其前體糖苷配基的干擾產(chǎn)生假陽性。

核糖體工程基于突變菌株的抗性篩選標(biāo)記而建立，降低了篩選壓力，其原理為：核糖體蛋白編碼基因的一些點突變可以使菌株增強(qiáng)對某些抗生素的抗性，這些抗生素也可能會使得核糖體蛋白發(fā)生突變，從而影響次級代謝[32]。然而核糖體工程選育的正向突變率極低，Zhang等[33]設(shè)計了一種即插即用的激活次級沉默基因簇方法：通過轉(zhuǎn)入帶有目標(biāo)突變的核糖體蛋白序列的質(zhì)粒來實現(xiàn)抗性篩選的最終目的，極大地提高了抗性篩選效率。

當(dāng)前已報道用于須糖多孢菌的誘變方法有：NTG 誘變[29]、核糖體工程（鏈霉素篩選[32]、巴龍霉素篩選[34]），分別使丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提升至1.87倍、2.20倍、1.80倍。未來研究者可借鑒刺糖多孢菌誘變提產(chǎn)多殺菌素的經(jīng)驗，使用更加多元的誘變方法得到性狀優(yōu)良的須糖多孢菌。

3 基因工程改造生產(chǎn)菌株

丁烯基多殺菌素與多殺菌素合成途徑相似，涉及23 個基因，其相關(guān)序列具有94%的同源性，主要區(qū)別在于busA比spnA多5244 bp（圖3），其負(fù)責(zé)在C21 尾部形成“丁烯基”而非乙基[35]。丁烯基多殺菌素生物合成途徑的19個基因都位于一個79 kb基因簇中：busA～E編碼聚酮合酶（PKS）形成大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，busF、busJ、busL、busM使大環(huán)內(nèi)酯分子形成交聯(lián)橋，busG、busK、busI、busH用于鼠李糖的添加及甲基化，busO、busN、busQ、busR、busS、busP用于福樂糖胺基團(tuán)的合成和添加；鼠李糖生物合成的4 個基因（gtt、gdh、epi、kre）分布于其他三個不同區(qū)域[36]，生物合成途徑如圖4所示。當(dāng)前須糖多孢菌的基因工程改造研究較少，為提升丁烯基多殺菌素產(chǎn)量，可借鑒多殺菌素研究經(jīng)驗，未來可用的基因工程改造策略主要有：代謝流調(diào)控、途徑基因調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和異源生物合成。

圖3 多殺菌素（上）和丁烯基多殺菌素（下）生物合成基因簇對比簡圖Fig.3 Comparison of spinosyn(up)and butenyl-spinosyn(down)biosynthetic gene clusters

圖4 丁烯基多殺菌素生物合成途徑Fig.4 Biosynthesis pathway of butenyl-spinosyn

3.1 代謝流調(diào)控

多殺菌素及其結(jié)構(gòu)類似物的生物合成由兩部分構(gòu)成，即聚酮鏈合成和糖基修飾，聚酮鏈以丙酸為起始，由丙酰輔酶A、丙二酰輔酶A 等作為直接前體合成聚酮鏈；側(cè)鏈的鼠李糖基團(tuán)和福樂糖胺基團(tuán)由共同前體葡萄糖1 磷酸經(jīng)多步反應(yīng)形成（圖5）。調(diào)控代謝流可使前體更多地流向目標(biāo)產(chǎn)物合成。

圖5 多殺菌素及丁烯基多殺菌素代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Metabolic network of spinosyn and butenyl-spinosyn

有研究表明誘變得到的高產(chǎn)菌株相比于野生菌株具有更高的初級代謝水平，這說明提高初級代謝可能增強(qiáng)次級代謝[37]，乙酰輔酶A 這一初級代謝物對于多殺菌素及其結(jié)構(gòu)類似物的合成至關(guān)重要[38]，可通過一系列代謝調(diào)控策略提高乙酰輔酶A含量。Liu 等[39]通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)敲除了PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）膦?；D(zhuǎn)移酶基因使多殺菌素產(chǎn)量提高2倍，該基因的敲除導(dǎo)致丙酮酸積累，進(jìn)而增加多殺菌素生物合成前體；該課題組[40]還過表達(dá)了可能影響乙酰輔酶A 合酶活性的脫乙?；騛cuC，多殺菌素產(chǎn)量提升近2倍。Huang 等[41]過表達(dá)了脂肪酸β 氧化相關(guān)的乙酰輔酶A 合成酶基因fadD1及脫氫酶基因fadE，增加了乙酰輔酶A 含量，使多殺菌素產(chǎn)量提升50%。

夏立秋團(tuán)隊在刺糖多孢菌中過表達(dá)了環(huán)腺苷酸受體蛋白編碼基因crp，破壞了亮氨酰氨肽酶編碼基因PepA，阻斷了磷酸甘露酶編碼基因manB，敲除了谷氨酰胺合成酶編碼基因glnA，這些基因影響碳氮代謝流向，多殺菌素產(chǎn)量分別提高28%、22%、80%和70%[42-45]。在須糖多孢菌的研究中，夏立秋等敲除參與核糖及氨基酸代謝的GDP-巖藻糖合成酶基因fcl，丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提升30%[46]；過表達(dá)鐵儲存調(diào)節(jié)基因bfr，使菌體對于鐵的利用度增強(qiáng)、菌密度增高、?；o酶A含量增加，丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提升3 倍[47]。此外還使用精簡基因組的策略，建立latour 系統(tǒng)敲除旁路雜合NRPS-T1PKS 基因簇（20 kb），使底物最大化流向目標(biāo)產(chǎn)物，丁烯基多殺菌素總產(chǎn)量提升4.72倍[48]。

數(shù)據(jù)模擬預(yù)測細(xì)胞信息是一種前景廣闊的方法。Wang 等[49]基于基因組信息、文獻(xiàn)資料及實驗數(shù)據(jù)建立了刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)（GSMR）模型，經(jīng)模型計算選擇了轉(zhuǎn)氫酶作為潛在目標(biāo)，過表達(dá)轉(zhuǎn)氫酶基因PntAB使得多殺菌素產(chǎn)量提高86%，這可能是由于轉(zhuǎn)氫酶保持了細(xì)胞還原力（NADPH/NADH）的平衡。

由此可見，乙酰輔酶A 這一前體物質(zhì)對于丁烯基多殺菌素的合成至關(guān)重要，后續(xù)研究可有目標(biāo)地提高這一前體物質(zhì)積累，可測定乙酰輔酶A 在發(fā)酵期的變化情況，從而加強(qiáng)對菌株代謝特性的了解；多數(shù)次級代謝產(chǎn)物提產(chǎn)的菌株被證明碳氮代謝流的流向發(fā)生改變，改變培養(yǎng)基成分或構(gòu)建基因工程菌來引導(dǎo)代謝流向丁烯基多殺菌素合成是必要的；大數(shù)據(jù)預(yù)測及模擬已滲透到基礎(chǔ)研究的方方面面，其可大大降低實驗人員的工作量，為研究者提供可參考的預(yù)測，減少試錯工作，提高研究效率。

3.2 途徑基因調(diào)控

多殺菌素及其結(jié)構(gòu)類似物合成步驟較多，途徑基因表達(dá)不足是多殺菌素產(chǎn)量低的主要原因。張曉琳等[50]將多殺菌素合成基因簇上的19 個基因按照轉(zhuǎn)錄方向分為9 個轉(zhuǎn)錄子，分別以轉(zhuǎn)錄子內(nèi)的一個基因為代表分析了高產(chǎn)菌株和低產(chǎn)菌株的各轉(zhuǎn)錄子表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量均有上升，尤其是spnM、spnJ-K-L、spnG-H、spnF和spnA-B-CD-E轉(zhuǎn)錄子有了很大幅度的上升，這表明過表達(dá)途徑基因可提高多殺菌素產(chǎn)量，且聚酮合酶基因（busA～E）、交聯(lián)橋基因（busJ、busF、busL、busM）、鼠李糖添加及甲基化基因（busG、busH、busI、busK）可能是限速步驟。

目前關(guān)于多殺菌素的研究表明：提高鼠李糖合成相關(guān)酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖基甲基化酶可大大提升多殺菌素的產(chǎn)量，研究者過表達(dá)了gtt、gdh、kre、spnS、spnQ、spnN、spnO、spnP、spnR和spnK基因提產(chǎn)3.9倍[51]，過表達(dá)除spnA～E外的其他相關(guān)編碼基因提產(chǎn)2.9倍[52]，過表達(dá)gtt和gdh基因提產(chǎn)近2倍[53]，過表達(dá)S-腺苷蛋氨酸合成酶基因metK1提產(chǎn)53%[24]。

Rang 等[54]對比了須糖多孢菌與刺糖多孢菌的蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)后，發(fā)現(xiàn)參與丁烯基多殺菌素生物合成的蛋白質(zhì)總體豐度很低，通過過表達(dá)鼠李糖合成相關(guān)基因（gtt,gdh,epi,kre）和蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶基因metK，使丁烯基多殺菌素產(chǎn)量分別提高2.7倍和3.0倍。后續(xù)可借鑒多殺菌素的研究經(jīng)驗過表達(dá)其他途徑基因，尤其是聚酮合成基因，它是丁烯基多殺菌素合成的基礎(chǔ)。

3.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

基因的表達(dá)水平會受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，包括途徑特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，目前還未發(fā)現(xiàn)特異性調(diào)控多殺菌素及其結(jié)構(gòu)類似物生物合成的基因。

當(dāng)前已報道的丁烯基多殺菌素相關(guān)研究大多集中在轉(zhuǎn)錄因子工程方面，雖無特異性調(diào)控因子，但經(jīng)過組學(xué)分析均發(fā)現(xiàn)全局轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)改變了菌株代謝流分布。夏立秋課題組[55-61]近年來在須糖多孢菌中調(diào)控了多個全局轉(zhuǎn)錄因子并得到了較好結(jié)果（表2）。

3.4 異源生物合成

須糖多孢菌生長緩慢、遺傳背景不夠清晰，基因工程策略受限于低的外源基因轉(zhuǎn)化效率和基因編輯效率，采用合適的異源宿主來生產(chǎn)多殺菌素及其結(jié)構(gòu)類似物可以避開這一瓶頸，同樣屬于放線菌的鏈霉菌被認(rèn)為是異源生產(chǎn)天然次級代謝產(chǎn)物的理想宿主。鏈霉菌中含有許多合成次生代謝物的途徑，因此它們擁有合成目標(biāo)天然產(chǎn)物的必需元素，對生物活性天然產(chǎn)物也有很強(qiáng)的耐受性，此外，很多可用的基因編輯系統(tǒng)在鏈霉菌中被成功開發(fā)，這使得在鏈霉菌中合成目標(biāo)天然產(chǎn)物成為可能[62-63]。

Song 等[64]創(chuàng)建了RedEx 方法實現(xiàn)將busA中相比于spnA多余的5.3 kb 基因無縫插入spnA，經(jīng)基因簇優(yōu)化在Streptomyces. albusJ1074 異源表達(dá)后得到了2.36 mg/L 丁烯基多殺菌素A，這也證明了多殺菌素的生物合成途徑也能用于丁烯基多殺菌素的合成。

當(dāng)前研究者已成功在Streptomyces albusJ1074、Streptomyces coelicolorM145、Streptomyces lividansTK24和Saccharopolyspora erythraea中實現(xiàn)了多殺菌素的異源合成（表3）。其中，Song 等[67]創(chuàng)造性地將23 個生物合成基因分成7 個操縱子，分別利用組成型啟動子表達(dá)，最終實現(xiàn)了多殺菌素異源合成；Huang等[69]采用同為糖多孢菌屬的Sa.erythraea作為異源表達(dá)宿主，將紅霉素合成途徑PKS 替換為了多殺菌素合成途徑的PKS，最終實現(xiàn)了多殺菌素高產(chǎn)，這可能歸功于選擇了與原生產(chǎn)菌株親緣關(guān)系較近的宿主。

由此可見，選擇合適的異源表達(dá)宿主及快捷高效的長片段基因克隆方法對目標(biāo)產(chǎn)物的合成至關(guān)重要。

4 展 望

丁烯基多殺菌素這一綠色生物農(nóng)藥具有廣闊的應(yīng)用前景，尚需選育高產(chǎn)菌株提升其產(chǎn)量。然而當(dāng)前研究還存在以下問題：傳統(tǒng)的誘變方法具有一定的隨機(jī)性，當(dāng)前篩選通量難以滿足龐大的篩選工作；精準(zhǔn)的基因工程方法受限于低的遺傳操作效率；大型次級基因簇在實驗室環(huán)境下表達(dá)較弱。

針對以上問題，開發(fā)適用的高通量篩選方法，建立自動化篩選平臺，可大幅度減少工作量、縮短獲得高產(chǎn)菌株進(jìn)程；探索須糖多孢菌基因轉(zhuǎn)化及編輯低效的原因，選擇并優(yōu)化基因編輯方法，對底盤宿主進(jìn)行改造，開發(fā)內(nèi)源基因編輯系統(tǒng)，縮短基因操作周期，加速基因工程育種；現(xiàn)有實驗室培養(yǎng)條件無法再現(xiàn)原生態(tài)環(huán)境條件，大多數(shù)次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇表達(dá)較弱，且這些基因簇一般較大，可通過共培養(yǎng)及激活分子增加培養(yǎng)環(huán)境適合度、調(diào)節(jié)全局或特異性調(diào)節(jié)因子的表達(dá)、重構(gòu)途徑基因簇及異源表達(dá)等策略激活大基因簇[70]，實現(xiàn)次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的大幅提升。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等的發(fā)展為揭示須糖多孢菌低產(chǎn)丁烯基多殺菌素的原因帶來了大量信息，如何快速抓取有效信息成為一大難題。在合成生物學(xué)和計算機(jī)模擬的指導(dǎo)下，研究者已經(jīng)在提高多殺菌素產(chǎn)量及發(fā)現(xiàn)新化合物上取得了較大的進(jìn)步，如基于人工智能的定量構(gòu)效關(guān)系直接導(dǎo)致了乙基多殺菌素的發(fā)現(xiàn)，計算機(jī)輔助模擬與設(shè)計推動了一系列模擬物的發(fā)現(xiàn)與構(gòu)建[71]，但當(dāng)前大多數(shù)實驗室的工作效率難以匹配龐大的數(shù)據(jù)信息，大數(shù)據(jù)分析及全自動化工作平臺成為引領(lǐng)研究方向的必要組成部分。