腫瘤中DNA甲基化和小RNA的關聯研究現狀

何 苗（綜述），王子衛(wèi)（審校）

（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普通外科，重慶 400016）

表觀遺傳指不涉及DNA序列改變的，可隨細胞分裂而遺傳的基因組修飾作用，包括DNA甲基化（DNA methylation）、組蛋白修飾（如乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化等）、染色質重塑、基因組印跡、RNA干擾（RNA interference，RNAi）等。表觀遺傳參與基因表達調控，提供DNA編碼信息的時空表達指令。表觀遺傳學即研究表觀遺傳現象規(guī)律的科學，主要從基因組修飾角度研究基因表達的調控機制。DNA甲基化和RNA干擾（特別是小RNA）是表觀遺傳學研究焦點和重心。不少研究證實，DNA甲基化異常或RNA干擾異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關［1］?，F就DNA甲基化與小RNA基本理論進行概述，并綜述它們在腫瘤研究中的聯系。

1 DNA甲基化理論概述

DNA甲基化是在甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）作用下，由S-腺苷酰-L-甲硫氨酸提供甲基，在DNA分子胞嘧啶5號碳原子上結合甲基團，形成5-甲基胞嘧啶，生成甲基化DNA［2］。其有如下特點:常發(fā)生于DNA分子5'-CpG-3'序列，而基因啟動子常富集CpG序列（即CpG島）;作用于DNA復制后，轉錄前，不改變DNA一級結構調控基因轉錄;是哺乳動物細胞內DNA合成后唯一自然修飾方式。DNA甲基化調控基因轉錄的機制是:甲基化DNA與甲基化CpG結合蛋白（methyl-CpG-binding protein，MeCPs）結合，MeCPs的MBD結構域（methyl-CpG-binding domain，MBD）通過招募組蛋白去乙?；感纬赊D錄抑制復合物，進而促使染色體形態(tài)改變，不利于DNA解旋和解鏈，最終抑制基因轉錄［3］。即 DNA 甲基化抑制基因轉錄。通常各種細胞具有相對特異的基因組甲基化譜，這在促進組織器官發(fā)育、維持細胞正常功能、調節(jié)細胞適應環(huán)境等方面發(fā)揮重要作用。但腫瘤細胞中，正常甲基化模式異常改變，表現為全基因組廣泛低甲基化及抑癌基因高甲基化［4］，目前在不同腫瘤中已證實多種抑癌基因高甲基化，且與腫瘤分化、侵襲、轉移、臨床分級、復發(fā)、預后等密切相關［5］。故各類腫瘤相對特異的異常甲基化譜可望用于腫瘤診治［6］。

2 小RNA理論概述

RNAi是部分特殊RNA誘導同源基因mRNA降解或抑制其翻譯，從而調節(jié)基因表達的現象。RNAi通常是轉錄后水平的遺傳信息調控（區(qū)別于DNA甲基化的轉錄水平）。目前，腫瘤中對RNAi現象的研究集中在小RNA，包括微小RNA（microRNA，miRNA）和小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）。

2.1 miRNA基本理論 miRNA是一類長18～26 nt的非編碼小分子核苷酸，源于生物自身基因組。細胞核內miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ作用下先產生初級 miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA在胞核內被RNA酶Ⅲ切割為發(fā)夾狀miRNA前體（pre-miRNA），pre-miRNA再被 exportin-5轉運至細胞質，由 RNA酶Ⅲ進一步切割為 miRNA:miRNA雙鏈［7］，然后其中一條鏈被降解，遂形成成熟miRNA。miRNA可與RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）選擇性結合，成熟單鏈miRNA在RISC中通過堿基互補結合于同源基因mRNA，并降解或抑制該mRNA翻譯，從而調控基因表達［8］（圖1）。人類基因中約1/3受miRNA表達調控，涉及生長、發(fā)育、凋亡、增殖、腫瘤等領域。由于miRNA源于生物自身基因組，故基于miRNA的RNAi是生物自身參與基因表達調控的方式。

2.2 siRNA基本理論 siRNA源于雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）。dsRNA分子在胞質中經RNA酶Ⅲ切割為21～23 nt的小片段，即形成siRNA。siRNA在解旋酶作用下分解為兩條單鏈，由反義鏈與核酸內切酶、外切酶、解旋酶等結合形成RISC。單鏈siRNA在RISC中與同源基因mRNA通過堿基配對結合，并降解此mRNA或抑制其翻譯，從而實現基因轉錄后表達調控［9］（圖1）。因 dsRNA源自外來病毒、轉座子或自身基因組，故基于siRNA的RNAi是生物自身及外來遺傳物質參與基因表達調控的共同途徑。

3 DNA甲基化與小RNA在腫瘤中的關聯研究

3.1 miRNA的DNA甲基化調控 腫瘤研究已證實部分腫瘤相關miRNA受DNA甲基化轉錄調節(jié);腫瘤中miRNA異常與其基因甲基化異常相關。例如Hashimoto等［10］采用 miRNA 芯片及定量反轉錄-聚合酶鏈反應研究胃癌，發(fā)現胃癌組織及細胞中miR-181c顯著降低，而miR-181c基因CpG島是異常甲基化的;用甲基轉移酶抑制劑5-aza-CdR處理胃癌細胞可激活miR-181c，并抑制胃癌增殖。Ando等［11］也發(fā)現具有抑癌作用的miR-124a在正常胃黏膜、癌旁組織、胃癌組織中表達逐漸降低，而其基因異常甲基化程度卻在上述組織中逐漸明顯，并與Hp感染顯著相關。Tsai等［12］研究人19號染色體的miRNA基因簇（C19MC），也發(fā)現胎盤組織中C19MC因序列上游17.6 kb處CpG島低甲基化而高表達，但在胃癌細胞AGS和宮頸癌細胞HeLa中卻因高甲基化而不表達;5-aza-CdR可激活C19MC并抑制AGS及HeLa增殖。Huang等［13］研究子宮內膜癌，也發(fā)現miR-129-2異常表達與其異常甲基化相關。Vrba等［14］研究乳腺上皮腫瘤和乳腺間質腫瘤，也證實miR-200c表達差異受DNA甲基化和組蛋白修飾調節(jié)。類似發(fā)現還很多，提示DNA甲基化不僅調節(jié)蛋白編碼基因的表達，也調節(jié)miRNA。

3.2 間接作用于DNA甲基化的miRNA 這里的“間接作用”指部分miRNA通過靶向抑制DNMTs或MeCP2而間接改變腫瘤基因甲基化譜，從而間接調節(jié)腫瘤基因轉錄。例如，Das等［15］探索了全反式維甲酸促進神經母細胞瘤分化的表觀遺傳機制。發(fā)現神經母細胞瘤中全反式維甲酸可促進miR-152表達，而miR-152可靶向抑制甲基轉移酶DNMT1和DNMT3B，從而激活了因異常甲基化而失活的82種基因，最終促進腫瘤分化。Braconi等［16］探索了炎性因子白細胞介素6參與膽管上皮癌發(fā)生的表觀遺傳機制。發(fā)現白細胞介素6可抑制miR-148a、miR-152、miR-301表達，而這些 miRNA正好靶向抑制 DNMT1;高表達的 DNMT1促使抑癌基因 Rassf1a及p16INK4a異常甲基化并失活，終致腫瘤發(fā)生。Garzon等［17］研究急性髓樣白血病也發(fā)現，miR-29b可靶向抑制甲基轉移酶DNMT3A和DNMT3B，從而改變基因組甲基化譜;如抑癌基因p15和ESR1就在轉染miR-29b后因啟動子去甲基化而激活，進而抑制癌細胞。

Wada等［18］研究8種胃癌細胞及11例胃癌組織，發(fā)現 miR-212在胃癌中顯著降低;而轉染 primiR-212可抑制胃癌細胞增殖。進一步試驗證實，miR-212靶向抑制甲基化CpG結合蛋白MeCP2;轉染pri-miR-212可抑制MeCP2蛋白表達，但不影響其mRNA水平。因MeCP2是參與DNA甲基化抑制轉錄的重要功能蛋白，故推測miR-212可通過調節(jié)MeCP2而影響基因甲基化對轉錄的調節(jié)。

利用生物信息學技術（如miRanda、PicTar等）還可預測很多靶向DNMTs及MeCPs的miRNA。結合上述研究，推測miRNA不僅受DNA甲基化轉錄調節(jié)，也間接反作用于DNA甲基化，并調節(jié)轉錄。

3.3 間接作用于DNA甲基化的siRNA siRNA是RNA干擾的重要成員，但腫瘤研究中對內源性siRNA關注較少，故甚少見DNA甲基化調節(jié)siRNA的報道。目前siRNA常為人工合成，并作為抑制靶基因的科研工具而廣泛用于腫瘤基因功能研究。已不少學者發(fā)現，靶向抑制 DNMTs和 MeCPs的外源性siRNA可間接調節(jié)腫瘤基因甲基化譜。如 Deng等［19］構建Dnmt3a-siRNA并將之轉染黑素瘤細胞，發(fā)現Dnmt3a被剔除后，黑素瘤細胞中主要組織相容復合體Ⅰ（MHCⅠ）、主要組織相容復合體Ⅱ（MHCⅡ）、反式作用子Ⅱ（Ciita）等基因發(fā)生去甲基化并重新表達，進而抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉移。Lopez-Serra等［20］研究了 MeCPs的 MBD 結構域，構建靶向MBD-mRNA的siRNA，發(fā)現抑制MBD后，宮頸癌細胞HeLa中部分因異常甲基化而失活的基因可重新表達，進而抑制腫瘤細胞增殖。Kim等［21］研究一種特殊甲基轉移酶Dnmt3L。構建Dnmt3L-siRNA轉染癌細胞，發(fā)現Dnmt3L被剔除后，共有242種基因甲基化譜發(fā)生改變，其中204種的甲基化譜是Dnmt3L與 Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b共同參與調節(jié)的，而有15種基因甲基化譜是由Dnmt3L單獨調節(jié)的，如胸腺嘧啶轉葡糖激酶等。Kurita等［22］構建DNMT1-siRNA及DNMT3b-siRNA轉染肝癌細胞，發(fā)現肝癌的增殖受抑制及凋亡增加，且對化療的敏感性增強。進一步試驗證實，DNMT1及 DNMT3b被siRNA剔除后，肝癌中因啟動子甲基化而失活的caspase-8可重新轉錄，進而抑制肝癌。目前，這種DNMTS-siRNA介導的腫瘤基因甲基化調節(jié)逐漸被重視，并可望用于腫瘤基因治療。

3.4 直接作用于DNA甲基化的siRNA及miRNA“直接作用”指不通過靶向DNMTs而直接結合靶基因并誘導其DNA甲基化。例如，Kawasaki等［23］研究乳腺癌細胞MCF-7，發(fā)現靶向E-cadherin及HER2啟動子CpG島的外源性siRNAs可顯著促進兩種基因啟動子甲基化，并抑制它們轉錄。進一步試驗發(fā)現，剔除 DNMT1和 DNMT3B后，上述 siRNA介導的DNA甲基化抑制現象則消失。提示siRNA可靶向結合基因啟動子，并在DNMTs作用下促進該基因甲基化，進而抑制轉錄。Tan等［24］研究了多種腫瘤細胞，發(fā)現 miR-10a可抑制 hoxd4表達。分析原因發(fā)現miR-10a可靶向結合hoxd4啟動子CpG島，并促進hoxd4啟動子甲基化;且用甲基轉移酶抑制劑處理癌細胞后，上述miR-10a介導的hoxd4甲基化轉錄抑制也消失。提示miRNA亦可靶向結合基因啟動子，并通過DNMTs促進基因甲基化而抑制轉錄。

上述siRNA或miRNA直接靶向基因并導致啟動子甲基化的機制尚不清。有學者認為這種小RNA介導的靶基因甲基化修飾是通過轉錄因子TTF-1，并被DNMT3b特異識別而實現的［25］。腫瘤中類似研究尚少，需繼續(xù)探索。

4 總結及展望

miRNA及siRNA與DNA甲基化調節(jié)轉錄的關系十分密切。miRNA不僅受DNA甲基化轉錄調節(jié)，也通過靶向Dnmts或MeCPs間接反作用于基因甲基化。這是對miRNA靶向mRNA在轉錄后水平調節(jié)基因表達的補充。siRNA通常是轉錄后水平抑制靶蛋白表達的科研工具，現也證明靶向Dnmts或MeCPs的siRNA可間接改變基因組甲基化譜，從而用于腫瘤治療。此外，植物中內源性siRNA可直接結合靶基因并調節(jié)其DNA甲基化譜［26］;雖類似的siRNA或miRNA直接介導靶基因甲基化的報道已在腫瘤中出現，但還相對欠缺，且腫瘤中內源性siRNA是否受DNA甲基化調節(jié)也不清楚，故需繼續(xù)探索。

細胞發(fā)生癌變時常先出現表觀遺傳異常，例如，抑癌基因異常甲基化、癌基因去甲基化、miRNAs異常表達等。對它們的檢測和調節(jié)將對腫瘤診治產生巨大影響，這是腫瘤基因診療未來的研發(fā)方向。具體歸納如下:①探索各類腫瘤不同階段基因組甲基化譜差異和miRNAs差異，為腫瘤分子診斷提供依據;②異常甲基化的病因研究，為腫瘤預防提供理論依據;③腫瘤基因異常甲基化靶向治療研究，在轉錄水平治療腫瘤;④建立siRNA穩(wěn)定轉染并持續(xù)作用的方法，在轉錄后水平治療腫瘤;⑤因RNAi機制復雜，且其靶向性并非絕對特異，故人工RNAi技術對細胞的毒副作用尚待探索。

近年表觀遺傳學在腫瘤方面的研究突飛猛進，但人們清楚的仍舊是冰山一角。表觀遺傳貫穿生命全過程，作用巨大，人類表觀基因組計劃是宏偉而艱苦的工程，需要更多學者前赴后繼地探索。

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