DNA甲基化與宮頸癌的研究進展

巫劍紅（綜述），代蔭梅（審校）

（首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心，北京 100026）

宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤第2位，是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一［1］。人類乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染被認為是宮頸癌病因?qū)W最重要的危險因素，幾乎存在于所有的宮頸癌中。雖然HPV的感染只是宮頸癌發(fā)生的必需但病因不充分，即在宮頸癌的自然形成過程中尚需要其他輔助因素的參與，但其誘導宮頸癌變發(fā)生的分子生物學機制尚不明確。近年的研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學的改變可能在宮頸癌變發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，這提示通過檢測基因的甲基化水平來進行宮頸癌的早期診斷具有重要的臨床意義，DNA甲基化可能作為有效的分子標志物應用于宮頸癌篩查［2］?，F(xiàn)就DNA甲基化與宮頸癌關系的研究進展予以綜述。

1 DNA甲基化與CpG島

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要研究內(nèi)容，其實質(zhì)是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methytrasferase）的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基共價結(jié)合到胞嘧啶的第5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的過程。幾乎所有的甲基化胞嘧啶殘基都出現(xiàn)在對稱序列的5'-GC-3'核苷酸（5'-GC-3'nucleotide，CpG）上。在哺乳動物基因組中，CpG二核苷酸以兩種形式存在:一種分散于DNA中，約70%以甲基化形式存在，可稱其為甲基化CpG位點;另一種是非甲基化的CpG二核苷酸高度聚集在基因的5'端，其范圍為0．5～2．0 kb，富含CG（60%～70%），稱 CpG島（CpG island）。人類基因組中約有45 000個CpG島，以非隨機化的方式分布于蛋白編碼基因的啟動子和第一外顯子區(qū)域，雖然僅占基因組DNA的1%～2%，但存在于所有管家基因和少量組織特異基因的5'端調(diào)控區(qū)。CpG島在正常組織中處于非甲基化狀態(tài)，而在腫瘤組織中卻被甲基化，這種甲基化狀態(tài)的改變抑制基因轉(zhuǎn)錄，使基因表達沉默，從而誘發(fā)細胞癌變，是引起腫瘤發(fā)生的一個重要因素。

2 DNA異常甲基化與宮頸癌

目前很多研究已經(jīng)在多種腫瘤中證實腫瘤相關基因的異常甲基化現(xiàn)象，如p16甲基化是表觀遺傳學上腫瘤抑制基因失活的典型。近20年來，國內(nèi)外對宮頸癌DNA甲基化的研究也越來越多，研究中采用了各種各樣的方法分析宮頸脫落細胞、宮頸活檢組織和血漿樣本，證明了宮頸癌中DNA甲基化現(xiàn)象的普遍存在。

2009年，Wentzensen等［3］對 Medline中的文獻進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)共有51項研究對4376例宮頸癌樣本的68種不同基因的甲基化狀態(tài)進行了研究，其中在5項或超過5項的研究中分析了15種基因，7種基因的甲基化頻率在宮頸癌中＞60%，其中死亡相關蛋白激酶 1（death-associated protein kinase，DAPK1）、細胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM1）和β視黃酸受體（retinoic acid receptorβ，RAR-β）在整個研究中始終顯示出甲基化增高。這些數(shù)據(jù)說明，在宮頸癌腫瘤組織中基因甲基化現(xiàn)象廣泛存在。不僅如此，研究還發(fā)現(xiàn)，部分基因甲基化的頻率隨著宮頸病變級別的增加而增加，甲基化基因的數(shù)目也隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變程度的加重而增多［4-7］。這提示DNA甲基化發(fā)生于宮頸癌變過程的早期階段，表觀基因不穩(wěn)定性逐漸增加可能與宮頸病變逐漸加重有關。但目前研究涉及的有關基因數(shù)目眾多，研究結(jié)果各異。Feng等［8］采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation-specific PCR，MSP）技術研究了319例脫落細胞樣本中21個甲基化基因，最后確定了3個基因（DAPK1、RAR-β和堿性螺旋蛋白基因）對檢測宮頸浸潤癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ的靈敏度和特異度較高，均為95%。Kim等［9］采用巢式MSP技術檢測12個基因的甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAR-β、堿性螺旋蛋白基因和O-6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因最能區(qū)別鱗狀細胞癌/鱗狀上皮內(nèi)高度瘤變（squamous cell carcinomas/high-grade SIL，SCC/HSIL）和鱗狀上皮內(nèi)低度病變/正常宮頸組織（low-grade SIL/normal cervix，LSIL/NC），靈敏度和特異度分別為 78．7% 和 82．2%。Apostolidou 等［10］在HSIL/NC的液基細胞樣本中，采用熒光定量MSP方法研究了28個基因，發(fā)現(xiàn)3個基因（同源盒基因、同源框A11基因和CADM1）的甲基化水平明顯升高，并且證明同源框A11基因可作為液基細胞樣本的DNA甲基化標志物。這些結(jié)果表明，即使同一個基因，在各項研究中的DNA甲基化水平也相差很大。

上述研究都是隨機選擇已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的在腫瘤中普遍甲基化的基因，逐個評估它們在宮頸癌及癌前病變中的甲基化狀態(tài)。近年來，隨著甲基化檢測的深入開展，涌現(xiàn)出限制性標記基因組掃描、甲基化敏感性隨機引物MSP、甲基化CpG島擴增和甲基化基因芯片等高通量檢測甲基化的新技術。應用這些新技術可以直接針對宮頸癌篩選出甲基化變異程度最高的基因。Lai等［11］采用 CpG島芯片技術在 NC、LSIL、HSIL和SCC樣本中分析基因甲基化狀態(tài)，篩選出了6個新的甲基化基因:同源盒基因、配對核基因X1、LIM同源框轉(zhuǎn)錄因子1基因、NK6轉(zhuǎn)錄因子相關基因座1、Wilm's腫瘤基因和ONECUT1（one cut homeobox 1），并評估了這6個基因的甲基化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)配對核基因X1的甲基化變異程度最高，對于SCC的靈敏度和特異度分別為86%和82%，對于HSIL/SCC的靈敏度和特異度分別為54%和99%。Wang等［12］采用限制性標記基因組掃描技術檢測20例SCC和NC的甲基化狀態(tài)，最早篩選出核仁蛋白基因和脂肪瘤高遷移率組融合配偶體4基因在宮頸癌中存在明顯甲基化。Sova等［13］利用表達芯片篩選浸潤性宮頸癌的差異表達基因，然后分析差異表達基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)了分泌型富含半胱氨酸酸性蛋白基因、組織因子旁路抑制物2基因、Ras相關糖尿病基因、分泌型卷曲相關蛋白1基因、富含半胱氨酸金屬硫蛋白1G基因和15號染色體開放閱讀框架48基因的甲基化與浸潤性宮頸癌相關。高通量檢測技術大大促進了宮頸癌早期診斷甲基化標志物的篩查工作。但是，目前尚未真正篩選到滿足臨床需要的高特異度敏感診斷標記的甲基化基因，仍需要進一步發(fā)現(xiàn)更好、更多的甲基化標志物，以提高敏感性和特異性。

3 DNA甲基化在宮頸癌診斷中的臨床應用前景

宮頸癌是全世界婦女死亡的主要疾病之一。近年來細胞學篩查大大降低了宮頸癌的發(fā)生率和病死率，但是在可疑微小病灶中，它的敏感性低，重復率差，尤其對于宮頸上皮內(nèi)低度病變組織。HPV-DNA和宮頸細胞學聯(lián)合檢測使初步篩查宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ及以上的敏感性大大提高。然而，高危HPV檢測在診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變時雖然具有敏感性，但是缺乏特異性，HPV-DNA檢測結(jié)果陽性幾乎都只提示暫時性的感染而非浸潤性宮頸癌的結(jié)局，許多HPV陽性的患者并不發(fā)展為宮頸癌，而是處于雙向發(fā)展趨勢。因此，需要尋求合適的方法對HPV-DNA陽性患者進行分類，以判斷宮頸病變的發(fā)展趨勢，從而確定下一步的工作是繼續(xù)隨訪還是臨床干預。

為此，有人提議引進DNA甲基化標志物來提高傳統(tǒng)細胞學篩查的效果。利用DNA甲基化標志物篩查宮頸癌的優(yōu)點是:①DNA甲基化標志物性質(zhì)穩(wěn)定，從而使檢測可行。②可在前一次作細胞學檢查的殘留樣本中檢測，避免患者再次門診，更加方便經(jīng)濟，減少資源浪費。③利用熒光定量MSP方法只需少量腫瘤細胞或腫瘤細胞的DNA片段即可檢測到DNA甲基化，而用液基細胞學方法檢測時，因樣本中含有很多正常宮頸細胞，可能檢測不到相對較少的異常細胞，從這個角度來說，熒光定量MSP檢測可能優(yōu)于細胞形態(tài)學檢測［14］。然而，DNA甲基化標志物也存在缺陷。作為篩查宮頸癌的一種方法，最重要的先決條件是:①測量的可靠性，而各種甲基化基因在各項研究中甲基化水平差異很大。②檢測疾病時較高的敏感性和特異性，從而有較高的陽性預測值。而在Wentzensen等［3］綜合分析的68種基因中，甲基化水平最高的3個基因（DAPK1、CADM1和RAR-β）在宮頸癌中的平均甲基化率只有30%，因此單個DNA甲基化基因篩查宮頸癌的特異性并不高。

對此，有些研究者采用甲基化基因標記系列篩選宮頸癌。Wisman等［15］在宮頸癌病例組和正常對照組的宮頸涂片中采用熒光定量MSP技術檢測了12個基因的甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關肽基因、雌激素受體基因、組織金屬蛋白酶抑制因子3、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因、DAPK和RAR-β的甲基化水平在宮頸癌中明顯高于對照組。降鈣素基因相關肽基因、雌激素受體基因、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因和DAPK標記系列檢測的靈敏度達89%，與細胞形態(tài)學和高危HPV檢測的靈敏度（89%和90%）一致，而特異度優(yōu)于細胞形態(tài)學和高危HPV檢測（100%、83% 和68%）。Kahn等［16］采用熒光定量MSP技術分析了HSIL、LSIL和正常宮頸組織的液基細胞中免疫球蛋白超家族基因、分泌型富含半胱氨酸酸性蛋白基因、組織因子旁路抑制物2基因和DAPK的甲基化頻率和水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個基因的甲基化頻率在HSIL樣本中都高于LSIL，這4個基因的甲基化標記系列可用于區(qū)分 HSIL和 LSIL/NC。Wentzensen等［3］認為 DAPK1、CADM1 和 RAR-β 聯(lián)合檢測可能是最理想的，還有研究顯示甲基化標記系列結(jié)合黏附分子3、人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因、紅細胞膜41L3基因和13號染色體開放閱讀框架18基因較好［17］。然而，假如這些甲基化標志物互相排斥，完全獨立，或者只是從一定程度上關聯(lián)，都會影響標志物系列的覆蓋范圍，從而對標志物聯(lián)合檢測的敏感性產(chǎn)生重要影響。因此，如果沒有經(jīng)過正式的評估和標準方法的驗證，這些都是不確定的。Lai等［11］實驗中同時對宮頸拭子進行HPV和配對核基因X1檢測比單獨進行HPV檢測提高了HSIL/SCC檢測的靈敏度（從60%到80%），而特異度變化不大（63%和64%），這說明，采用HPV和DNA甲基化聯(lián)合檢測，高敏感性和高陽性預測值的檢測相結(jié)合的方法是最理想的。從臨床意義上來說，對HPV檢查結(jié)果陽性的患者，進一步進行DNA甲基化檢測，可以篩查出一部分HPV陽性卻沒有嚴重宮頸病變的患者，減少陰道鏡活檢的傷害［18，19］。

Widschwendter等［20］首次在宮頸癌患者的血清樣本中檢測降鈣素基因相關肽基因、人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因、肌原決定基因、孕酮受體基因和組織金屬蛋白酶抑制因子3的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿DNA中肌原決定基因沒有甲基化的患者比甲基化的患者存活率高，提示血漿中檢測出的肌原決定基因甲基化可用于宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復發(fā)的預后標志物。Yang等［21］在研究中發(fā)現(xiàn)CADM1的甲基化與宮頸癌的浸潤程度和宮頸淋巴血管間隙浸潤有關，提示CADM1在宮頸癌的轉(zhuǎn)移和浸潤中有重要作用。這說明，DNA甲基化標志物不僅可用于宮頸癌的早期診斷，還可用于判斷宮頸癌的腫瘤轉(zhuǎn)移程度、臨床預后及是否復發(fā)。

4 展望

目前，國內(nèi)外對宮頸癌甲基化的研究已有大量報道，發(fā)現(xiàn)了一大批基因的甲基化與宮頸癌發(fā)生有關，但尚未真正篩選出在靈敏度和特異度方面都能滿足臨床需要的甲基化標志物。既往的研究多是針對一種或多種在其他腫瘤中常見的甲基化基因在宮頸癌組織中進行表達評估，而針對宮頸癌特異的甲基化基因進行全基因組的系統(tǒng)篩選的研究甚少。因此，需要開展新的平臺來檢測大量的CpG島DNA甲基化位點，從而發(fā)現(xiàn)更好更多的宮頸癌DNA甲基化標志物，并通過獨立樣本實驗驗證這些新的標志物，以最終確定高特異度的敏感診斷標記。從經(jīng)濟效益和可行性考慮，未來宮頸癌的人群篩查方法可能是建立在HPV聯(lián)合DNA甲基化的檢測系統(tǒng)上，這種聯(lián)合可達到100%的靈敏度，且特異性高于只用HPV或細胞學的方法。另外，甲基化早期診斷在臨床上往往適合于非創(chuàng)傷性的樣本。總之，采用全基因組篩選宮頸癌甲基化基因的方法，找到最適合的甲基化標志物，進而在宮頸涂片樣本中檢測宮頸癌甲基化標志物是未來的研究方向。宮頸癌DNA甲基化標志物將為臨床宮頸癌的早期診斷和治療提供新的思路和方法。

［1］Parkin DM．Global cancer statistics in the year 2000［J］．Lancet Oncol，2001，2（9）:533-543．

［2］Widschwendter A，Gattringer C，Ivarsson L，et al．Analysis of aberrant DNA methylation and human papillomavirus DNA in cervicovaginal specimens to detect invasive cervical cancer and its precursors［J］．Clin Cancer Res，2004，10（10）:3396-3400．

［3］Wentzensen N，Sherman ME，Schiffman M，etal．Utility ofmethylation markers in cervical cancer early detection:Appraisal of the state-of-the-science［J］．Gynecol Oncol，2009，112（2）:293-299．

［4］Shivapurkar N，Sherman ME，Stastny V，et al．Evaluation of candidatemethylation markers to detect cervical neoplasia［J］．Gynecol Oncol，2007，107（3）:549-553．

［5］LiMEH，Ng SL，Li JL，et al．Cervical dysplasia:Assessingmethylation status（Methylight）of CCNA1，DAPK1，HS3ST2，PAX1 and TFPI2 to improve diagnostic accuracy［J］．Gynecol Oncol，2010，119（2）:225-231．

［6］Lai HC，Lin YW，Huang RL，et al．Quantitative DNA methylation analysis detects cervical intraepithelial neoplasms type3 and worse［J］．Cancer，2010，116（18）:4266-4274．

［7］Henken FE，Wilting SM，Overmeer RM，et al．Sequential gene promoter methylation during HPV-induced cervical carcinogenesis［J］．Brit JCancer，2007，97（10）:1457-1464．

［8］Feng QH，Balasubramanian A，Hawes SE，etal．Detection of hypermethylated genes in women with and without cervical neoplasia［J］．JNatl Cancer Inst，2005，97（4）:273-282．

［9］KiMJH，Choi YD，Lee JS，et al．Assessment of DNA methylation for the detection of cervical neoplasia in liquid-based cytology specimens［J］．Gynecol Oncol，2010，116（1）:99-104．

［10］Apostolidou S，Hadwin R，BurnellM，etal．DNAmethylation analysis in liquid-based cytology for cervical cancer screening［J］．Int J Cancer，2009，125（12）:2995-3002．

［11］Lai HC，Lin YW，Huang TH，et al．Identification of novel DNA methylation markers in cervical cancer［J］．Int JCancer，2008，123（1）:161-167．

［12］Wang SS，Smiraglia DJ，Wu YZ，et al．Identification of novelmethylation markers in cervical cancer using restriction landmark genomic scanning［J］．Cancer Res，2008，68（7）:2489-2497．

［13］Sova P，F(xiàn)eng Q，Geiss G，et al．Discovery of novelmethylation biomarkers in cervical carcinomaby global demethylation andmicroarray analysis［J］．Cancer EpideMBiomar，2006，15（1）:114-123．

［14］Reesink N，Wisman G，Jeronimo C，et al．Detecting cervical cancer by quantitative promoter hypermethylation assay on cervical scrap-ings:a feasibility study［J］．Mol Cancer Res，2004，2（5）:289-295．

［15］Wisman GB，Nijhuis ER，Hoque MO，et al．Assessment of gene promoter hypermethylation for detection of cervical neoplasia［J］．Int JCancer，2006，119（8）:1908-1914．

［16］Kahn SL，Ronnett BM，Gravitt PE，et al．Quantitative methylationspecific PCR for the detection of aberrant DNA methylation in liquid-based pap tests［J］．Cancer Cytopathol，2008，114（1）:57-64．

［17］Eijsink J，Yang N，Lendvai A，et al．Detection of cervical neoplasia by DNA methylation analysis in cervico-vaginal lavages，a feasibility study［J］．Gynecol Oncol，2011，120（2）:280-283．

［18］Lin CJ，Lai HC，Wang KH，et al．Testing for methylated PCDH10 orWT1 is superior to the HPV test in detecting severe neoplasms（CIN3 or greater）in the triage of ASC-USsmear results［J］．AMJ Obstet Gynecol，2011，204（1）:e12-e13．

［19］Hesselink AT，Haideman DA，Steenbergen RD，et al．Combined promotermethylation analysis of CADM1 and MAL:An objective triage tool for high-risk human papillomavirus DNA-positivewomen［J］．Clin Cancer Res，2011，17（8）:2459-2465．

［20］Widschwendter A，Müller HM，F(xiàn)iegl H，et al．DNA methylation in seruMand tumorsof cervical cancer patients［J］．Clin Cancer Res，2004，10（2）:565-571．

［21］Yang N，Nijhuis ER，Volders HH，et al．Gene promotermethylation patterns throughout the process of cervical carcinogenesis［J］．Cell Oncol，2010，32（1/2）:131-143．