β-防御素及其與呼吸道疾病關(guān)系研究*

趙文娟 陳文慧 姚 政 陳 滟

云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南省昆明市 650500

防御素是一類廣泛存在于皮膚和黏膜上皮組織中具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽。近年來發(fā)現(xiàn)防御素不僅通過直接殺菌作用抵御入侵機(jī)體的病原微生物,還在介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷修復(fù)過程中起著重要作用,是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。因此,對于它的研究目前越來越受到人們的廣泛關(guān)注。

1 β-防御素的發(fā)現(xiàn)

防御素是抗菌肽家族中最大的亞家族,是一類重要的內(nèi)源性抗菌肽。已從脊椎動物體內(nèi)分離出許多防御素,根據(jù)其空間結(jié)構(gòu)不同可分為3大類:α-防御素 、β-防御素 、θ-防御素 。 其中,β-防御素是 1991年Diamond等[1]首次在牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的短肽,命名為 TAP(tracheal antimicrobial peptide),后來又在牛的粒性白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了13種與TAP的序列高度同源的短肽,但其consensus序列與α-防御素不同,故被命名為β-防御素。人的β-防御素(Human β-defensin,HBD)目前已發(fā)現(xiàn)有 6種(HBD1～6)。人的第1種β-防御素(HBD-1)最初是在血液中發(fā)現(xiàn),人的第 2種β-防御素(HBD-2)是由角蛋白產(chǎn)生,從牛皮癬患者的皮膚中發(fā)現(xiàn)的,隨后又發(fā)現(xiàn)在腎、尿液、宮頸黏液、下頜唾液腺、胰腺、氣管、前列腺、胎盤、睪丸、胸腺及小腸細(xì)胞中都有HBD-2的表達(dá)。2000年 Harder等[2]從銀屑病患者的皮損組織中發(fā)現(xiàn)了人的第3種β-防御素(HBD-3),并采用金黃色葡萄球菌親和柱進(jìn)行了分離純化,從蛋白水平上發(fā)現(xiàn)了HBD-3。通過局部比對搜索工具(BLAST),發(fā)現(xiàn)了另外3種β-防御素(HBD4～6)。

2 β-防御素的分子結(jié)構(gòu)

成熟的β-防御素包含36～50個氨基酸殘基,包括6個半胱氨酸殘基(Cysl-5,2-4,3-6)以獨(dú)特的空間模式形成二硫鍵,與 α-防御素相區(qū)別。Cys2-Cys4橋在多肽核內(nèi)引入環(huán)狀共價鏈。β-防御素分子內(nèi)含3個反向平行的β-折疊鏈,由3個分子內(nèi)二硫鍵連接。β-片層與一個可變長度的α-螺旋片段連接,形成分子N末端片段。α-螺旋和β-片層的連接位點(diǎn)是通過二硫鍵來穩(wěn)定的(Cysl-Cys5)。β-防御素有形成多種低聚結(jié)構(gòu)的潛能 ,這些低聚結(jié)構(gòu)影響著防御素蛋白的生物學(xué)活性和功能[3]。

3 β-防御素的生物學(xué)活性

3.1 抗菌活性 β-防御素抗菌譜較廣,是機(jī)體抵御外界微生物侵襲的第一道化學(xué)屏障。在機(jī)體固有免疫防御中發(fā)揮重要作用。β-防御素能廣泛殺滅G+菌和G-菌,體外試驗(yàn)表明,β-防御素能夠抑制大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母等,除了對肺炎克雷伯氏菌沒有明顯的抑制效果外,對以上幾種病原菌和熱帶白假絲酵母有抑菌作用,兩者的最低作用濃度(MIC)為6～50mg/ml[4]。一般認(rèn)為β-防御素的直接殺菌機(jī)制是由于該分子帶正電,能與帶負(fù)電荷、呈陰性的細(xì)菌表面結(jié)合,結(jié)合后其分子中的疏水區(qū)可插入到細(xì)菌胞膜,而帶電區(qū)(帶正電荷)則與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂頭部以及水分子相互作用。在細(xì)胞膜上多個β-防御素分子聚集形成孔隙或道。使正常情況下處于胞外的離子、多肽等流入胞內(nèi),而胞內(nèi)重要的鹽類、大分子等泄漏到胞外,造成物質(zhì)泄漏,最終導(dǎo)致不可逆性的菌體死亡[5]。

3.2 抗其他病原生物的活性 β-防御素能殺滅一些被膜病毒,如人類免疫缺陷病毒、皰疹病毒、水泡型口炎病毒、流感病毒等,但對無衣殼病毒卻無效。β-防御素對病毒的殺滅作用依賴于其分子內(nèi)二硫鍵的緊密程度、防御素的濃度等因素,還與pH值、溫度等因素有關(guān),在中性及低離子強(qiáng)度條件下,防御素具有較強(qiáng)的抗病毒活性[6]。此外,β-防御素對某些真菌、梅毒螺旋體和鉤端螺旋體、分枝桿菌等均有很強(qiáng)的抗菌活性,β-防御素還能有效地殺死引起人類及動物寄生蟲病的病原體,如瘧疾、chagas氏病、利什曼病的病原體。1998年,Shahabuddin研究發(fā)現(xiàn)防御素對瘧原蟲感染蚊子的不同時期有不同的作用。瘧原蟲的卵囊期和子孢子期較其他時期對防御素敏感,而且防御素對瘧原蟲卵囊期的損傷有時間依賴性,一般感染3d后,卵囊密度明顯降低[7]。

3.3 抗腫瘤細(xì)胞的活性 在體外試驗(yàn)研究純化的β-防御素對人及小鼠數(shù)種腫瘤細(xì)胞的作用情況,發(fā)現(xiàn)β-防御素對白血病細(xì)胞系、淋巴瘤細(xì)胞系及實(shí)體瘤細(xì)胞具有毒性作用,并且這種抗腫瘤功效與其作用時間和劑量呈正相關(guān)。對人淋巴細(xì)胞及實(shí)體瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用更為顯著,尤其對抗 TNF的U9TR細(xì)胞、小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞和人組織細(xì)胞淋巴瘤U937細(xì)胞具有殺傷性[8,9]。

3.4 免疫活性 β-防御素不僅可以直接抵抗病原微生物,而且還具有免疫活性作用。HBD-2是肥大細(xì)胞的趨化因子,可引起肥大細(xì)胞活化和脫顆粒,致組胺和前列腺素釋放,進(jìn)一步使中性粒細(xì)胞在炎癥部位移動和聚集[10]。這種趨化作用通過肥大細(xì)胞的高親和力受體完成。同時,HBD-2不僅對幼稚樹突狀細(xì)胞有趨化作用,還對記憶型T細(xì)胞有趨化性。近來Yang等報道,小鼠β-防御素-2能刺激小鼠幼稚樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟樹突狀細(xì)胞。β-防御素通過與趨化因子-6(CCR6)結(jié)合,趨化誘導(dǎo)幼稚樹突狀細(xì)胞和記憶T細(xì)胞聚集到炎癥部位,介導(dǎo)共刺激分子(如B7家族成員)的表達(dá)上調(diào)和幼稚樹突狀細(xì)胞的成熟,進(jìn)而活化 T淋巴細(xì)胞,觸發(fā)體內(nèi)強(qiáng)有力的特異性免疫應(yīng)答[11]。此外,防御素還可以直接促進(jìn)感染部位中性粒細(xì)胞的補(bǔ)充和積聚,也有研究表明β-防御素能夠激活人的補(bǔ)體系統(tǒng)[12]。

4 β-防御素與呼吸道疾病的相關(guān)研究

4.1 β-防御素與上呼吸道疾病 目前已發(fā)現(xiàn)β-防御素廣泛存在于鼻黏膜組織中,其功能的失活與病原微生物定植、集落于黏膜上皮而導(dǎo)致嚴(yán)重的感染關(guān)系密切,也可能參與鼻黏膜正常防御功能。β-防御素基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的上調(diào)與機(jī)體鼻黏膜系統(tǒng)發(fā)揮抗感染作用密切相關(guān)。Lee等[13]發(fā)現(xiàn)HBD-2 mRNA只在慢性鼻竇炎患者的下鼻甲黏膜和鼻息肉中檢測到,且在鼻息肉中的水平明顯高于鼻甲黏膜,這與參與鼻息肉形成的多種細(xì)胞因子,包括白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-5、嗜酸性粒細(xì)胞誘導(dǎo)了HBD-2表達(dá)有關(guān)。β-防御素與咽喉部疾病的關(guān)系主要體現(xiàn)在慢性扁桃體炎中。腭扁桃體是咽黏膜相關(guān)淋巴組織的重要組成部分。王成碩等[14]應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的方法檢測了慢性扁桃體炎組和正常對照組的扁桃體組織中HBD-1和HBD-2 mRNA的表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:HBD-1在正常扁桃體和慢性扁桃體炎組織中均有表達(dá),而HBD-2在單純增生的扁桃體組織僅微弱表達(dá),但在慢性扁桃體炎組織中表達(dá)明顯升高。這表明HBD-1在扁桃體組織中為固有性表達(dá),而HBD-2則為誘導(dǎo)性表達(dá)。以上結(jié)果與HBD在其他組織中的表達(dá)特點(diǎn)一致,說明扁桃體作為機(jī)體的“門衛(wèi)”,是通過天然免疫和獲得性免疫兩種系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)、相互補(bǔ)充來共同發(fā)揮作用的。此外,扁桃體上皮能夠表達(dá)HBD這一事實(shí),也提示耳鼻咽喉科醫(yī)師應(yīng)充分認(rèn)識到扁桃體的天然免疫功能而慎行扁桃體切除手術(shù)。

4.2 β-防御素與下呼吸道疾病 肺囊性纖維化患者氣道有各種菌(常見綠膿桿菌和金葡菌等)定植和慢性感染過程,但這種感染只局限于呼吸道,而不造成全身擴(kuò)散,說明是呼吸道局部防御功能缺陷所致。肺囊性纖維化是常染色體隱形遺傳性疾病,是由囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFT R)失去功能所致,CFTR是cAMP調(diào)節(jié)的氯通道。肺囊性纖維化的特點(diǎn)是氣道中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng),慢性細(xì)菌感染和氣道阻塞。氣道過度炎性反應(yīng)是CFT R喪失功能所致還是繼發(fā)于感染,在肺囊性纖維化患者的支氣管肺泡灌(BALF)中能檢測到HBD-1和HBD-2,HBD-2隨著肺功能的惡化而下降。說明防御素活性的改變可能是CF患者容易感染的原因之一[15]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)與HBD-1的基因多態(tài)性的發(fā)生有關(guān)。吸煙者只有10%～20%會發(fā)生COPD,因此除了環(huán)境因素外,遺傳因素參與COPD的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)中國漢族人群中編碼HBD-1的基因HDEFBl 668C/G多態(tài)性與COPD易感性有關(guān),HBD-3表達(dá)于支氣管和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞,細(xì)菌性肺炎患者急性期血漿HBD-3濃度升高,治療結(jié)束后明顯降低。說明HBD-2參與氣道的抗微生物過程,并且可作氣道炎癥反應(yīng)的有用標(biāo)志物[16]。

5 展望

防御素不僅是新型高效的抗菌物質(zhì),而且作為機(jī)體本身的一種活性物質(zhì),相對不具有免疫原性,病原菌也不易對其產(chǎn)生耐藥性,因此可以替代抗生素發(fā)揮廣譜高效的抗菌作用。此外防御素能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)組織創(chuàng)傷修復(fù)。因此,可以誘導(dǎo)β-防御素的表達(dá),來增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力和免疫力。目前已有的誘導(dǎo)劑由于其毒性作用,難以直接作用于人體和用于今后的臨床開發(fā),是否存在安全有效的誘導(dǎo)劑便成為研究關(guān)注的焦點(diǎn)。

數(shù)千年來中藥在防治疾病方面發(fā)揮了重要的作用,研究表明大多數(shù)具有良好抑菌作用的中藥是通過全面提高機(jī)體免疫功能、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力而達(dá)到抗菌目的。防御素的多種生物學(xué)活性給人們一個重要啟示:中藥有可能是通過誘導(dǎo)先天性免疫分子防御素的分泌發(fā)揮抗菌作用而啟動機(jī)體有效的抗感染。如果中藥確實(shí)能夠增加內(nèi)源性防御素的表達(dá),那么在天然防御素獲得困難的情況下,毫無疑問這一點(diǎn)對防御素開發(fā)成為抗生素也提供了新的思路。目前筆者研究團(tuán)隊(duì)開展了關(guān)于玉屏風(fēng)散影響上呼吸道黏膜β-防御素mRNA表達(dá)情況的研究,進(jìn)而探索玉屏風(fēng)散對上呼吸道黏膜非特異性免疫分子的作用機(jī)制,促進(jìn)中藥誘導(dǎo)劑有效的研究及為中藥的新藥開發(fā)研究打下基礎(chǔ),并期望將祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥作為解決臨床耐藥菌的新治療途徑。

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