杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析*

閻赟夢，李慶華，李 杰，柴丹丹，薛樂勛

鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年6月生，教授，研究方向:生物工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析*

閻赟夢，李慶華，李 杰，柴丹丹，薛樂勛#

鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年6月生，教授，研究方向:生物工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻;S腺苷高半胱氨酸水解酶;鞭毛

目的:探討杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)基因在鞭毛再生中的作用。方法:通過設計簡并引物及RACE法克隆了杜氏鹽藻SAHase基因全長，使用pH休克法對杜氏鹽藻進行鞭毛去除及再生，通過實時熒光定量PCR研究在轉(zhuǎn)錄水平上SAHase基因的變化。結(jié)果:所克隆的杜氏鹽藻SAHase基因cDNA全長1 926 bp，包含ORF 1 458 bp、3’UTR 61 bp和5’UTR 407 bp。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在鞭毛再生的過程中，SAHase mRNA轉(zhuǎn)錄量升高，其水平在3 h時達到了未處理組的3倍左右。結(jié)論:杜氏鹽藻的SAHase基因與鞭毛再生有關。

S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)參與真核生物最主要的甲基化反應——以S-腺苷甲硫氨酸(S-Met)為甲基供體的甲基化反應［1］。S-Met在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基轉(zhuǎn)移給供體，生成S-腺苷高半胱氨酸(S-Hcy)，后者經(jīng)SAHase催化生成高半胱氨酸和腺苷。抑制SAHase將導致S-Hcy積累，S-Hcy與S-Met競爭結(jié)合甲基轉(zhuǎn)移酶，進而反饋抑制甲基化作用［2］。同時，作為腺苷結(jié)合蛋白，SAHase還調(diào)控著胞內(nèi)游離腺苷濃度［3］。

鞭毛是廣泛存在于各類細胞表面的細胞器，結(jié)構(gòu)高度保守，參與細胞運動、感知外界刺激和細胞信號轉(zhuǎn)導，在維持細胞正常生命活動中發(fā)揮重要作用。雖然對鞭毛內(nèi)運輸、蛋白組裝研究得比較多，但到目前為止，鞭毛長度的調(diào)控機制依然不清楚［4］。最近，有研究［5］報道甲基化作用可能參與了鞭毛再生過程的調(diào)控。杜氏鹽藻是一種高度耐鹽的單細胞真核生物，具有雙鞭毛，鞭毛長度約10 μm，便于觀察。作者克隆杜氏鹽藻SAHase基因全長，采用實時熒光定量PCR方法觀察分析轉(zhuǎn)錄水平上SAHase與杜氏鹽藻鞭毛再生的關系，初步探討甲基化作用在鞭毛再生過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 藻株與培養(yǎng) 杜氏鹽藻UTEX LB-1644購自美國德州大學，采用改良PKS鹽藻培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度26℃，光照強度4 500 Lux，光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)各12 h。

1.2 試劑 LaTaq酶、限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RACE試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品，實時熒光定量染料購自天根公司。

1.3 杜氏鹽藻SAHase基因全長的克隆

1.3.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 取對數(shù)生長期杜氏鹽藻1 mL，2 000 r/min離心5 min，收集沉淀，培養(yǎng)基洗沉淀1次，再次離心收集沉淀。Trizol法裂解細胞，提取總RNA。總RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳和吸光度檢測，純度符合要求，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 簡并引物擴增SAHase基因片段 根據(jù)萊茵衣藻等物種SAHase基因的保守序列設計一對簡并引物:上游5’-AA(A/G)ATGTA(T/C)(C/A) GNATGG-3’，下游5’-TCNAC(G/A)CA(G/A) TANGG(G/A)TC(T/G/A)AT-3’。PCR擴增條件: 95℃預變性4 min;95℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán);最后72℃延伸10 min，4℃終止反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后膠回收，與pMD18-T載體 16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α，進行藍白斑篩選，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，取鑒定插入片段大小正確的單克隆送樣測序，進行進一步鑒定。

1.3.3 RACE法擴增基因全長 根據(jù)巢式PCR原理，設計 2個上游引物 5’-TGTATGGCTGCCGT CACTCT-3’和5’-CGTGTTGTGGTGTCGGAGAT-3’。下游引物為3’-RACE試劑盒中自帶的3’-RACE Inner Primer 5’-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCAC TATAGG-3’和3’-RACE Outer Primer 5’-TACCG TCGTTCCACTAGTGATTT-3’。按照3’-RACE說明書上的反應條件設置反應程序。提取總RNA，按照5’-RACE試劑盒說明書去帽進行反轉(zhuǎn)錄，設計5’-Race引物5’-CACAATGGCGTCGTTCTTCA和TCTC CGACACCACAACACGA-3’，與試劑盒中自帶引物的內(nèi)外側(cè)配對，按照5’RACE說明書上的反應條件設置反應程序。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，回收產(chǎn)物。藍白斑篩選，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定正確的單克隆送樣測序。

1.4 實時熒光定量PCR 使用pH休克法去除杜氏鹽藻鞭毛［6］，參照王翠等［7］的研究，在去除鞭毛后的420 min內(nèi)每30 min取樣1次，用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設計一對引物5’-AAC ATCGTGGGCGTGTCTGA-3’和5’-ATGCGGTCTTGC CAGAAATC-3’，以GAPDH作為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR。

2 結(jié)果

2.1 SAHase基因片段的RT-PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果

PCR擴增得到長度為327 bp的片段(圖1)。使用NCBI數(shù)據(jù)庫對測序結(jié)果進行Blast分析，結(jié)果顯示所得片段與萊茵衣藻 SAHase基因的同源性為84%，所得片段為杜氏鹽藻SAHase基因的一部分。

圖1 杜氏鹽藻SAHase cDNA片段RT-PCR擴增結(jié)果

2.2 RACE擴增及全長分析結(jié)果 3’-RACE PCR擴增得到長度為982 bp的片段，測序結(jié)果顯示這部分片段包含完整的polyA尾。5’-RACE擴增得到長度為921 bp的片段(圖2)。經(jīng)拼接后得到SAHase cDNA全長為1 926 bp，其中包括3’UTR 61 bp，5’UTR 407 bp，ORF 1 458 bp，編碼604個氨基酸，與萊茵衣藻同源性約為83%。

圖2 RACE擴增結(jié)果

2.3 實時熒光定量PCR結(jié)果 結(jié)果顯示，與未去除鞭毛時比較，在去除鞭毛后的420 min內(nèi)，SAHase基因的轉(zhuǎn)錄量升高，其中，第180 min時甚至達到了對照組的3倍(圖3)。

圖3 實時熒光定量PCR結(jié)果

3 討論

因為杜氏鹽藻基因組序列尚未公布，所以首先比對多個物種的SAHase基因序列，選擇保守區(qū)域，設計簡并引物，通過PCR與RACE法相結(jié)合擴增了杜氏鹽藻SAHase cDNA全長，經(jīng)測序得到了杜氏鹽藻SAHase cDNA序列，并提交GenBank。這為下一步研究SAHase基因與鞭毛長度調(diào)控之間的關系做好了準備工作。與其他物種的比對結(jié)果顯示，擴增得到的SAHase cDNA與其他物種序列同源性很高，說明在不同物種中，SAHase基因結(jié)構(gòu)高度保守。序列擴增過程中用到了RACE法，RACE法的主要目的是為了擴增基因的3’末端與5’末端。RACE結(jié)果的好壞主要取決于提取的RNA的質(zhì)量和制備的模板的質(zhì)量。一方面需要高質(zhì)量的RNA，保證無降解，另一方面模板制備過程中也要小心操作，避免RNA降解。

SAHase蛋白廣泛存在于各種生命體內(nèi)，調(diào)控細胞內(nèi)甲基化作用，直接或間接參與胞內(nèi)多種重要的生命活動，如DNA甲基化、RNA加帽、蛋白甲基化及cAMP信號通路等［8］。鞭毛蛋白質(zhì)組學分析證實SAHase蛋白是鞭毛蛋白組分之一，其催化底物AdoHcy也在鞭毛中存在［9］。Schneider等［5］證實甲基化途徑組分甲硫氨酸合酶(MetE)在鞭毛頂端存在，并且MetE在完整鞭毛中含量比較低，在再生鞭毛中含量高，在重吸收鞭毛中含量最高。作者采用PCR法擴增了杜氏鹽藻SAHase cDNA全長，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示鞭毛再生過程中SAHase的轉(zhuǎn)錄量明顯升高，證明SAHase在鞭毛再生過程中發(fā)揮重要作用，提示甲基化作用參與了鞭毛再生的調(diào)控。SAHase基因可能是通過以下途徑來調(diào)控鞭毛的再生:一方面，SAHase基因表達量的高低直接影響到甲基化途徑的效率［10］，DNA高甲基化狀態(tài)不利于基因的表達，低甲基化狀態(tài)有利于基因表達。因此，在鞭毛再生過程中SAHase大量轉(zhuǎn)錄，從而間接調(diào)控鞭毛組裝相關基因的表達。另一方面，在鞭毛內(nèi)可能存在完整的甲基化通路［5］。Schneider等［5］在重吸收的鞭毛中分離出一些高度甲基化的蛋白，這些蛋白大部分與軸絲相結(jié)合，且其甲基化形式在完整鞭毛和再生鞭毛中不存在，提示這些蛋白可能通過甲基化與非甲基化2種構(gòu)象的轉(zhuǎn)換來調(diào)控鞭毛再生。Sloboda等［11］也從鞭毛中分離出了3個與軸絲相結(jié)合的甲基化蛋白。以上研究均證實SAHase蛋白作為甲基化途徑的組分參與了鞭毛長度的調(diào)控。

在萊茵衣藻中，SAHase蛋白在鞭毛和胞體內(nèi)都存在。作者的研究結(jié)果顯示SAHase與鞭毛再生有關，至于鞭毛內(nèi)的SAHase蛋白是否參與了鞭毛內(nèi)某些蛋白的甲基化，以及這些蛋白是在胞體內(nèi)被甲基化后轉(zhuǎn)運至鞭毛還是在鞭毛內(nèi)發(fā)生了甲基化，尚有待進一步證實。

［1］田鈴，嵇保中，劉曙雯，等.甲基轉(zhuǎn)移酶的功能與分類［J］.生命的化學，2007，27(5):425

［2］李愛秀，劉興太，蔡德海.S-腺苷高半胱氨酸水解酶的晶體結(jié)構(gòu)及其催化機制［J］.生命的化學，2007，27(6):521

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［4］Pedersen LB，Rosenbaum JL. Intraflagellar transport (IFT)role in ciliary assembly，resorption and signalling［J］.Curr Top Dev Biol，2008，85:23

［5］Schneider MJ，Ulland M，Sloboda RD.A protein methylation pathway in Chlamydomonas flagella is active during flagellar resorption［J］.Mol Biol Cell，2008，19(10):4319

［6］Cheshire JL，Evans JH，Keller LR.Ca2+signaling in the Chlamydomonas flagellar regeneration system:cellular and molecular responses［J］.J Cell Sci，1994，107(Pt 9):2491

［7］王翠，李杰，柳麗平，等.杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3a功能結(jié)構(gòu)域的克隆與表達分析［J］.生物工程學報，2010，26(6):760

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［9］Pazour GJ，Agrin N，Leszyk J，et al.Proteomic analysis of a eukaryotic cilium［J］.J Cell Biol，2005，170(1):103

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［11］Sloboda RD，Howard L.Protein methylation in full length Chlamydomonas flagella［J］.Cell Motil Cytoskeleton，2009，66(8):650

Cloning and functional analysis of S-Adenosyl homocysteine hydrolase gene of Dunaliella salina

YAN Yunmeng，LI Qinghua，LI Jie，CHAI Dandan，XUE Lexun

Laboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;SAHase;flagellar

Aim:To investigate the function of the SAHase gene in flagellar regeneration of Dunaliella salina(D.salina).Methods:A pair of degenerate primers was designed to obtain a fragment of SAHase cDNA，and the RACE method was used to amplify the full length of the SAHase cDNA.The transcriptional level of the SAHase gene from D.salina was monitored by real-time fluorescence quantitative PCR during flagellar regeneration.Results:The results of PCR and RACE showed that the full length of the SAHase cDNA cloned in this study was 1 926 bp，consisting of ORF 1 458 bp，3’UTR 61 bp and 5’UTR 407 bp.The result of real-time fluorescence quantitative PCR indicated that abundance of the SAHase mRNA was induced during the process of the flagellar regeneration，reaching to about 3-fold higher than that without the treatment of pH shock.Conclusion:The SAHase gene is related to regeneration of the flagella of D.salina.

Q781

*國家自然科學基金資助項目 3070014;科技部國際科技合作基金資助項目 2007DFA01240

(2010-10-11收稿 責任編輯王 曼)