bromodomain結(jié)構(gòu)域?qū)︿鍏^(qū)包含蛋白7亞細(xì)胞定位的影響*

徐曉杰，周 鳴，李桂源#

1)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室南陽(yáng) 473000 2)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所分子遺傳室長(zhǎng)沙 410078 #通訊作者，男，1951年11月生，博士，教授，研究方向:鼻咽癌的分子遺傳學(xué)，E-mail:ligy@xysm.net

bromodomain結(jié)構(gòu)域?qū)︿鍏^(qū)包含蛋白7亞細(xì)胞定位的影響*

徐曉杰1)，周 鳴2)，李桂源2)#

1)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室南陽(yáng) 473000 2)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所分子遺傳室長(zhǎng)沙 410078 #通訊作者，男，1951年11月生，博士，教授，研究方向:鼻咽癌的分子遺傳學(xué)，E-mail:ligy@xysm.net

鼻咽癌;缺失突變;亞細(xì)胞定位;bromodomain;溴區(qū)包含蛋白7

目的:探討溴區(qū)包含蛋白7(BRD7)的亞細(xì)胞定位以及bromodomain結(jié)構(gòu)域?qū)RD7亞細(xì)胞定位的影響。方法:首先采用GFP介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位方法，在非洲綠猴腎COS7細(xì)胞中考察BRD7的亞細(xì)胞定位;然后分別構(gòu)建bromodomain缺失型的BRD7重組體pCMV-Myc/BRD7△brd和pEGFP-C2/BRD7△brd，并通過(guò)GFP介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位方法和間接免疫熒光方法，分別在COS7中考察bromodomain缺失型BRD7的亞細(xì)胞定位，從而探討B(tài)RD7的bromodomain結(jié)構(gòu)域?qū)ζ鋪喖?xì)胞定位的影響。結(jié)果:成功構(gòu)建了pCMV-Myc/BRD7△brd和pEGFP-C2/BRD7△brd。BRD7及bromodomain缺失型BRD7在COS7中均主要定位在細(xì)胞核，與染色質(zhì)的分布存在一定程度的相似性。結(jié)論:bromodomain結(jié)構(gòu)域的缺失并不影響B(tài)RD7的細(xì)胞核分布，但是在核內(nèi)的分布模式發(fā)生了一定的改變。

溴區(qū)包含蛋白7(BRD7)是中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所分子遺傳室通過(guò)cDNA代表性差異分析、文庫(kù)篩選等方法分離克隆的一個(gè)cDNA全長(zhǎng)新基因［1］。該基因在鼻咽癌細(xì)胞系和活檢組織中表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞計(jì)數(shù)、軟瓊脂集落形成、流式細(xì)胞分析及裸鼠成瘤等細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［2］結(jié)果均支持BRD7具有抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，提示BRD7為鼻咽癌抑瘤基因強(qiáng)有力的候選者。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)［3］結(jié)果顯示，BRD7可能通過(guò)Ras/MEK/ERK和Rb/ E2F 2條通路影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，使細(xì)胞停滯于G0/G1期。同時(shí)研究［4］發(fā)現(xiàn)，BRD7能夠與核轉(zhuǎn)錄因子BRD2、IRF2等發(fā)生交互作用，推測(cè)BRD7為一個(gè)潛在的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。BRD7含有一個(gè)bromodomain結(jié)構(gòu)域，屬于bromodomain家族成員。bromodomain是一種高度保守的結(jié)構(gòu)域，一般由60～110個(gè)氨基酸殘基組成。該家族的大多數(shù)成員與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，并證實(shí)了一些bromodomain蛋白是核轉(zhuǎn)錄因子，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［5］。因此，該研究主要探討B(tài)RD7的亞細(xì)胞定位，另一方面通過(guò)構(gòu)建BRD7的bromodomain缺失突變體，探討bromodomain結(jié)構(gòu)域?qū)RD7亞細(xì)胞定位的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞系 大腸桿菌JM109和真核表達(dá)質(zhì)粒(pEGFP-C2、pCMV-Myc)由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所分子遺傳室購(gòu)買(mǎi)并保存。插入了BRD7全長(zhǎng)cDNA的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-C2/BRD7和pCMV-Myc/BRD7由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所分子遺傳室構(gòu)建保存。非洲綠猴腎COS7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑和抗體 限制性內(nèi)切酶(XhoⅠ、PstⅠ和EcoRⅠ等)、T4 DNA連接酶購(gòu)自Promege公司，高保真酶(Pyrobest DNA聚合酶)、dNTP和T4多聚核苷酸激酶等購(gòu)自大連寶生物公司;抗Myc單克隆抗體(Ab-Myc)購(gòu)于Clontech公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Pirece公司;RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。

1.1.3 核苷酸引物的分析與合成、測(cè)序 利用Goldkey軟件分析設(shè)計(jì)好的引物，確認(rèn)引物內(nèi)無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物間無(wú)二聚體形成。P1(正義:5’-AAAGCTGCAAAGAAGCTGTTGCACTCA-3’;反義: 5’-CAATTGTCTCATCAGTTGATTCAAAGC-3’)為構(gòu)建BRD7的bromodomain(148～218)缺失突變體pCMV-Myc/BRD7△brd的引物;P2(正義:5’-AAT CTCGAGTATGGGCAAGAAGCACAAGAAGCACAAG-3’;反義:5’-ATACTGCAGTCAACTTCCACCAGGTC CACACTC-3’)為將bromodomain缺失型BRD7片段連接到pEGFP-C2載體中(構(gòu)建pEGFP-C2/BRD7△brd)的引物。所有引物合成和重組質(zhì)粒測(cè)序均由上海博亞公司完成。

1.2 bromodomain缺失型BRD7重組體的構(gòu)建①構(gòu)建bromodomain缺失型BRD7重組質(zhì)粒pCMVMyc/BRD7△brd。利用設(shè)計(jì)好的引物P1，以pCMVMyc-BRD7為模板。PCR反應(yīng)體系為50 μL:模板DAN 5 μL，高保真酶1 μL，引物4 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP 8 μL，ddH2O 27 μL。按如下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增:95℃變性5 min，94℃變性30 s，68℃退火延伸5.5 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán);72℃終末延伸10 min。產(chǎn)物回收純化后用T4 PNK進(jìn)行5’端磷酸化處理。最后用T4 DNA連接酶進(jìn)行自身環(huán)化連接，連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用EcoRⅠ對(duì)挑選克隆進(jìn)行初步鑒定后，送測(cè)序鑒定。②構(gòu)建pEGFP-C2/BRD7△brd重組體。采用設(shè)計(jì)的引物P2，以上述構(gòu)建好的pCMV-Myc/BRD7△brd質(zhì)粒為模板，按如下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增:95℃變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán);最后終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收純化后用XhoⅠ和PstⅠ消化接頭，再與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切消化的pEGFP-C2載體連接，最后轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒酶切鑒定與測(cè)序。

1.3 Western Blot 在6孔板中分別接種2.0× 105個(gè)/孔的 COS7細(xì)胞。次日，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至50%～70%后，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，分別將pCMV-Myc、pCMV-Myc/BRD7和pCMV-Myc/ BRD7△brd 3種質(zhì)粒各1.5～2.0 μg轉(zhuǎn)染到上述COS7中，瞬時(shí)表達(dá)后收獲細(xì)胞。采用三去污裂解緩沖液抽提細(xì)胞總蛋白［6］，蛋白樣品變性后經(jīng)120 g/ L的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。然后再經(jīng)50 g/L的脫脂奶封閉，Ab-Myc一抗4℃孵育過(guò)夜，相應(yīng)羊抗小鼠二抗37℃孵育1 h，ECL發(fā)光試劑顯色，膠片壓片后顯影、定影。

1.4 GFP介導(dǎo)的蛋白亞細(xì)胞定位 首先在6孔板的每個(gè)孔中分別放置一塊蓋玻片，然后接種1.5× 105個(gè)/孔的COS7細(xì)胞。按1.3方法分別將pEGFP-C2/BRD7、pEGFP-C2/BRD7△brd 2種質(zhì)粒各1.5～2.0 μg轉(zhuǎn)染到上述細(xì)胞中。瞬時(shí)表達(dá)后，取出蓋玻片。丙酮/甲醇(體積比1∶1)固定細(xì)胞，DAPI染色后，再于熒光顯微鏡下觀察、攝片。

1.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)考察蛋白的亞細(xì)胞定位 采用1.3方法分別將pCMV-Myc/BRD7和 pCMV-Myc/ BRD7△brd 2種質(zhì)粒各1.5～2.0 μg轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中，瞬時(shí)表達(dá)后，取出蓋玻片。丙酮/甲醇(體積比1∶1)固定細(xì)胞，抗原修復(fù)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行核抗原修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)0.25%Triton-100處理30 min，正常血清封閉30 min，Ab-Myc一抗4℃孵育過(guò)夜，Cy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗37℃孵育1 h。DAPI染色后，于熒光顯微鏡下觀察、攝片。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pCMV-Myc/BRD7△brd的鑒定 重組質(zhì)粒EcoRⅠ酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。若無(wú) bromodomain結(jié)構(gòu)域的缺失，則酶切產(chǎn)物片段應(yīng)為5 000 bp+760 bp;若有bromodomain結(jié)構(gòu)域的缺失，則酶切產(chǎn)物片段應(yīng)為5 000 bp+547 bp。故2號(hào)克隆為候選陽(yáng)性克隆，將2號(hào)克隆送測(cè)序鑒定(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明bromodomain結(jié)構(gòu)域已完整缺失，銜接處及整個(gè)BRD7編碼區(qū)無(wú)堿基缺失、錯(cuò)配和移位。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示外源表達(dá)的BRD7缺失型蛋白比野生型BRD7低，大小約為68 000，與預(yù)測(cè)大小完全一致(圖3)，表明bromodomain缺失型BRD7重組體pCMV-Myc/BRD7△brd構(gòu)建成功。

2.2 pEGFP-C2/BRD7△brd的鑒定 重組質(zhì)粒XhoⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4，發(fā)現(xiàn)1、2號(hào)克隆均為陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑選1號(hào)克隆送測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，重組體pEGFP-C2/BRD7△brd中BRD7的bromodomain結(jié)構(gòu)域完整缺失，無(wú)序列錯(cuò)配和閱讀框架改變(圖5)，表明 pEGFP-C2/BRD7△brd構(gòu)建成功。

圖4 XhoⅠ和PstⅠ雙酶切

圖5 pEGFP-C2/BRD7△brd重組體測(cè)序圖

2.3 bromodomain對(duì)BRD7蛋白亞細(xì)胞定位影響結(jié)果表明，bromodomain缺失并不影響B(tài)RD7的細(xì)胞核分布，但是在核內(nèi)的分布模式發(fā)生了一定的改變，野生型BRD7在核內(nèi)主要以細(xì)點(diǎn)狀或條索狀分布，相對(duì)均勻(圖6A和圖7A);bromodomain缺失型BRD7主要以顆粒狀分布，不規(guī)則(圖6B和圖7B)。

3 討論

BRD7含有一個(gè)bromodomain結(jié)構(gòu)域，屬于bromodomain家族成員。bromodomain是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的廣泛分布于多種生物中的一種高度保守的結(jié)構(gòu)域，一般由60～110個(gè)氨基酸殘基組成［5］。許多bromodomain蛋白家族成員的bromodomain結(jié)構(gòu)域參與了組蛋白的乙酰化作用，與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)聯(lián)。蛋白乙酰化和去乙?；堑鞍谆钚哉{(diào)節(jié)的一種重要形式，通過(guò)乙?；蛉ヒ阴；?，改變了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或是轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而使下游靶基因的表達(dá)水平發(fā)生改變［6-9］。先前的研究［10］發(fā)現(xiàn)，BRD7能夠和乙?；慕M蛋白 H3結(jié)合，說(shuō)明 bromodomain在BRD7基因功能發(fā)揮中可能起到了關(guān)鍵的作用。

轉(zhuǎn)錄因子有2種分布形式:胞核形式和潛在的胞質(zhì)形式;蛋白質(zhì)在這2種分布形式下的功能完全不同［11］。作者考察了BRD7在COS7細(xì)胞中的定位，發(fā)現(xiàn)BRD7主要定位在細(xì)胞核，呈條索狀或片狀分布。這種分布同活性染色質(zhì)的分布比較一致，也可能是其轉(zhuǎn)錄活性功能發(fā)揮的關(guān)鍵所在。文獻(xiàn)［12］報(bào)道，多種bromodomain家族的成員都有類似的分布模式，如BRD4等。因而B(niǎo)RD7在細(xì)胞內(nèi)的定位模式與其功能發(fā)揮是統(tǒng)一的。

缺失突變是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系常用的方法和手段，是架構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的橋梁和紐帶。BRD7是bromodomain蛋白家族的成員，其bromodomain結(jié)構(gòu)域可能在BRD7的亞細(xì)胞定位和功能發(fā)揮過(guò)程中起了關(guān)鍵的作用。為此作者通過(guò)一種新型PCR方法［13］構(gòu)建了bromodomain缺失的BRD7突變體，并通過(guò)測(cè)序和表達(dá)分析的方法進(jìn)行了證實(shí)。結(jié)果顯示，bromodomain缺失并不影響B(tài)RD7的細(xì)胞核分布，但是在核內(nèi)的分布模式發(fā)生了一定的改變。bromodomain缺失型BRD7主要以粗點(diǎn)狀分布，不規(guī)則;與野生型BRD7在核內(nèi)的分布模式存在一定不同。BRD4亦為bromodomain蛋白家族成員，含有2個(gè)bromodomain結(jié)構(gòu)域。野生型BRD4的核定位分布與活性染色質(zhì)的分布比較一致，但當(dāng)bromodomain缺失突變后(無(wú)論是單個(gè)bromodomain的缺失，還是雙bromodomain同時(shí)缺失)，BRD4在核內(nèi)的分布發(fā)生明顯改變，與染色質(zhì)的分布完全不同［14-15］，說(shuō)明bromodomain在BRD4的核內(nèi)分布模式上起了關(guān)鍵作用。

上述改變是否與BRD7的細(xì)胞生物學(xué)功能直接相關(guān)，仍有待于進(jìn)一步的研究。

［1］Wu M，Li X，Li X，et al.Signaling transduction network mediated by tumor suppressor/susceptibility genes in NPC［J］.Curr Genomics，2009，10(4):216

［2］Li XL，Wu MH，Li GY.Functional genomics of nasopharyngeal carcinoma susceptibility/suppressor gene［J］.Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2008，33(7):553

［3］李淑芳，周鳴，劉華英，等.BRD7調(diào)控Rb/E2F通路的分子機(jī)制研究［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007，34 (8):881

［4］Gyuris A，Donovan DJ，Seymour KA，et al.The chromatintargeting protein Brd2 is required for neural tube closure and embryogenesis［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1789 (5):413

［5］LeRoy G，Rickards B，F(xiàn)lint SJ.The double bromodomain proteins Brd2 and Brd3 couple histone acetylation to transcription［J］.Mol Cell，2008，30(1):51

［6］程曉麗，神吉智丈，李春燕，等.熱休克蛋白10和熱休克蛋白60的表達(dá)、純化及與線粒體DNA轉(zhuǎn)錄因子A相互結(jié)合［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，42(1):50

［7］孫陸果，馬克威.Prohibitin 2調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2轉(zhuǎn)錄因子活性的分子機(jī)制［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，35(5):774

［8］周鵬，何鳳田，劉東擘，等.人類乳頭瘤病毒18 E7原癌蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞系中組蛋白去乙?；?表達(dá)的下調(diào)作用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(2):139

［9］楊文婷，劉樹(shù)艷，鄭鵬生.轉(zhuǎn)錄因子KLF4在宮頸癌中的表達(dá)及意義［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，31 (1):22

［10］Senthilkumar R，Mishra RK.Novel motifs distinguish multiple homologues of Polycomb in vertebrates:expansion and diversification of the epigenetic toolkit［J］.BMC Genomics，2009，10:549

［11］李敏，紀(jì)澤泉，陳永達(dá).核轉(zhuǎn)錄因子-κB反義核酸對(duì)腎小球硬化細(xì)胞炎性反應(yīng)的干預(yù)［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2008，23(15):1190

［12］You J，Li Q，Wu C，et al.Regulation of aurora B expression by the bromodomain protein Brd4［J］.Mol Cell Biol，2009，29(18):5094

［13］殷德濤，王琳，尹峰燕，等.分化型甲狀腺癌組織中脆性組氨酸三聯(lián)體基因外顯子5、8純合性缺失及突變檢測(cè)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，43(2):242

［14］Lee AY，Chiang CM.Chromatin adaptor Brd4 modulates E2 transcription activity and protein stability［J］.J Biol Chem，2009，284(5):2778

［15］Lin YJ，Umehara T，Inoue M，et al.Solution structure of the extraterminal domain of the bromodomain-containing protein BRD4［J］.Protein Sci，2008，17(12):2174

Effects of bromodomain on subcellular localization of BRD7

XU Xiaojie1)，ZHOU Ming2)，LI Guiyuan2)1)Department of Pathology，Nanyang Medical School，Nanyang 473000 2)Department of Molecular Genetics，Cancer Research Institute，Xiangya School of Medicine，Central South University，Changsha 410078

nasopharyngeal carcinoma;deletion mutation;subcellular localization;bromodomain;BRD7

Aim:To investigate the subcellular localization of BRD7 and the effects of bromodomain on its localization.Methods:Firstly，the subcelluar localization of BRD7 was detected in COS7 cells by direct GFP fluorescence.Secondly，bromodomain deleted BRD7 mutations，pCMV-Myc/BRD7△brd and pEGFP-C2/BRD7△brd，were constructed to investigate the effects of bromodomain on the subcellular localization of BRD7 in COS7 cells by GFP fluorescence and indirect immunofluorescence.Results:It was found that BRD7 and bromodomain deleted BRD7 mutations were all mainly localized in nucleus，which was similar to the nuclear distribution of chromatin，to some extent.Conclusion:Bromodomain deletion may not affect the nuclear localization of BRD7，but the localization pattern of BRD7 in nucleus is changed.

R739.6

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30300175，30200135，30400238，30470367

(2010-11-25收稿 責(zé)任編輯姜春霞)