黃芪甲苷對H2O2致PC12細胞氧化應激損傷的保護作用

王世博，邱景富，白群華，李佳佳，和晉渝，高艷軍，于 超

(1.重慶醫(yī)科大學生命科學研究院，重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院重慶 400016，3.重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院，重慶 400016)

隨著全球人口的老齡化，帕金森病(Parkinson's disease，PD)、阿爾采末病(Alzheimer's disease，AD)等神經退行性疾病的發(fā)病率也逐漸增加，給家庭與社會帶來沉重的負擔。目前，PD、AD等神經退行性疾病的發(fā)病機制仍不是十分清楚。近年來的大量研究表明，線粒體功能損傷［1］、細胞凋亡［2］、內質網(wǎng)應激［3－4］、氧化應激以及氧自由基［5］損傷廣泛參與了其致病過程，其中氧化應激對于神經退行性疾病的發(fā)生發(fā)展起到非常重要的作用。因此，從天然產物中探索或發(fā)現(xiàn)抗氧化作用的化合物并闡明作用機制，對預防此類疾病的發(fā)生具有重要的現(xiàn)實意義。

傳統(tǒng)中藥黃芪具有抗氧化、清除自由基、抗炎等多種生物活性作用［6］，黃芪甲苷(AstragalosideⅣ，ASⅣ)為黃芪皂苷類單體成分，被認為是黃芪的主要活性成分。有報道表明，黃芪甲苷可有效延緩機體細胞的衰老過程，促進原代培養(yǎng)神經元增殖，抑制炎癥(如 LPS)對單核細胞的損傷［7－8］等作用，但黃芪甲苷是否能有效抑制氧化應激所致的神經元損傷，尚未見報道。本研究通過建立PC12細胞氧化應激體外模型，探討黃芪甲苷對PC12細胞氧化應激損傷的保護作用與機制，為有效防治神經退行性疾病提供有益的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞由中國科學院大連化學物理研究所提供;DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司。黃芪甲苷購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(黃芪甲苷的溶媒為DMSO，儲存液濃度為10 mmol·L－1，應用液濃度為 10 nmol·L－1及 100 nmol·L－1。)。H2O2購于重慶川東化工有限公司。Hoechst 33258染色液購于碧云天生物技術研究所。MTT(噻唑藍)試劑、Vit C、JC-1染料購于美國Sigma公司。蛋白裂解液以及β-actin抗體購于CST(Cell Signaling Technology)公司。ECL發(fā)光劑購于Millipore公司。Cyclin D1抗體、Cyclin A抗體、Phosphop38抗體、T-p38 MAPK抗體購于美國Santa Cruz公司。其它試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) PC12細胞按常規(guī)培養(yǎng)，DMEMF12培養(yǎng)基，10%Gibco胎牛血清，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.125% 胰酶消化傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 實驗分組及藥物處理 實驗分組為:正常對照組、H2O2(300 μmol·L－1)模型組、黃芪甲苷(10 nmol·L－1)+H2O2(300 μmol·L－1)低濃度處理組、黃芪甲苷(100 nmol·L－1)+H2O2(300 μmol·L－1)高濃度處理組及陽性對照 Vit C(200 mg·L－1)+H2O2(300 μmol·L－1)。孵育24 h 后，除正常對照組外，其余各組吸棄原培養(yǎng)液，加入含相同濃度藥物和相應濃度的H2O2培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育4 h后，檢測各項實驗指標。

1.4 MTT法檢測PC12細胞活力 選取對數(shù)生長期PC12細胞，接種于96孔板內，每孔加培養(yǎng)液200 μl，接種量8 000個/孔，待細胞長至孔底80%時進行實驗。實驗分組及藥物處理同“1.3”。細胞活力/%=處理組OD值 /空白對照組OD值×100%。

1.5 Hoechst 33258熒光核染色 將PC12細胞接種于12孔板內，實驗分組及藥物處理同“1.3”。12孔板內加入PBS洗3次，用4% 多聚甲醛室溫下固定細胞30 min，PBS洗3次，每孔加入300 μl Hoechst 33258染色液，室溫下避光染色5 min，PBS洗3次，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率、胞內ROS、細胞周期 實驗分組及藥物處理同“1.3”，胰酶消化收集各組細胞后，PBS洗3次，分別加入 AnnexinVFITC和PI染液，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

實驗分組及藥物處理同“1.3”，PBS洗3次，加入ROS熒光探針DCFH-DA置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，收集各組細胞后，PBS洗3次，流式細胞儀檢測細胞內ROS產生。

實驗分組及藥物處理同“1.3”，收集細胞后，PBS洗3次，加入70% 冰乙醇固定24 h以上，加入PI染液，37℃ 避光孵育20 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 Western blot分析 實驗分組及藥物處理同“1.3”，收集細胞后，加入 150 μl蛋白裂解液(含10%PMSF、10%Tyr抑制劑、10%Ser/Thr抑制劑)，冰上反復吹打，置低溫離心機于4℃、12 000×g離心15 min，取上清液加入5×的上樣緩沖液，煮沸10 min，電泳并轉PVDF膜。5% 脫脂奶粉封閉1 h后，分別使用 Cyclin D1、Cyclin A、Phosphop38、T-p38以及 β-actin單克隆抗體，4℃ 孵育過夜，PBST洗3次，二抗室溫下孵育1 h，PBS洗3次，ECL化學發(fā)光法進行顯影。

1.8 統(tǒng)計學處理 本文中的各項實驗每組均重復3次以上，采用SPSS 12.0軟件進行 統(tǒng)計學處理 ，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較采用t檢驗分析，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析法處理。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對H2O2作用PC12細胞活力的影響

為了確立PC12細胞損傷模型中合適的H2O2濃度，首先分析不同濃度的H2O2、不同作用時間下PC12細胞活力的變化。結果顯示:細胞活力與H2O2濃度及其作用的時間呈正相關，即與正常對照組相比，各實驗組細胞活力隨H2O2濃度增大而下降，隨H2O2作用時間延長而下降。其中300 μmol·L－1H2O2組，當作用時間為4h時細胞活力下降約為65% ，選取300 μmol·L－1H2O2濃度制作應激損傷模型(Fig 1)。

經篩選確定采用 10 nmol·L－1與 100 nmol·L－1濃度的黃芪甲苷，與PC12細胞孵育24 h。結果顯示:此濃度范圍的黃芪甲苷對PC12細胞的活力均不會產生影響(Fig 2)。但不同濃度黃芪甲苷預保護24 h后經H2O2處理4 h，其對PC12細胞活力有明顯作用。與H2O2模型組相比，100 nmol·L－1黃芪甲苷細胞活力明顯提高(P＜0.01)，與陽性對照組Vit C效果相當，見Fig 3。表明黃芪甲苷對H2O2誘導的PC12細胞的氧化應激損傷具有保護作用。

Fig 1 Viability losses in PC12 cells induced by H2O2under different concentrations and time

Fig 2 Viability change of PC12 cells treated by ASⅣunder different concentration circumstances after 24 h.

Fig 3 ASⅣinhibited H2O2-induced injury in PC12 cells

2.2 黃芪甲苷對H2O2作用PC12細胞內核酸的保護作用 H2O2對細胞核內的核酸有明顯的損傷，為了驗證黃芪甲苷對此類損傷是否具有保護作用，對上述實驗分組，采用熒光染色法進行測定?？瞻讓φ战M細胞核染色有均勻的低強度熒光，胞核較大(Fig 4A);H2O2模型組細胞核出現(xiàn)高強度集中的熒光，且胞核變小、濃集，呈現(xiàn)出凋亡細胞的特征(Fig 4B);加入黃芪甲苷預處理后，細胞核熒光強度隨劑量增加而降低，胞核逐漸恢復正常形態(tài)(Fig 4C、D)。表明黃芪甲苷對H2O2誘導的PC12細胞核內核酸的損傷具有保護作用。

2.3 黃芪甲苷對H2O2作用PC12細胞凋亡率的影響 既然黃芪甲苷對胞內核酸損傷有保護作用，借此，應觀察其對細胞凋亡的影響。由流式細胞儀檢測結果可知，H2O2模型組PC12細胞凋亡率為26.41% ，而黃芪甲苷不同濃度處理的細胞凋亡率分別恢復到9.71%(10 nmol·L－1)和 9.04%(100 nmol·L－1)，見Fig 5。提示黃芪甲苷的確具有抗氧化應激損傷所致細胞凋亡的能力。

2.4 黃芪甲苷對 H2O2作用 PC12細胞后胞內ROS產生及細胞周期的影響 為了探討黃芪甲苷對氧化損傷的保護機制，采用流式細胞儀檢測了其對細胞周期和胞內ROS的影響。結果與對照組比較，H2O2模型組ROS產量高達320% ，不同濃度(10 nmol·L－1和 100 nmol·L－1)黃芪甲苷組 ROS產量分別為292% 與170% ，與模型組相比藥物組對ROS的降低明顯(P＜0.01)(Fig 6)。提示黃芪甲苷可能通過降低胞內ROS的產生起到保護細胞的作用。

從細胞周期分析可以發(fā)現(xiàn):與對照組(G1期:50.24%;S期:43.93%)相比，H2O2模型組G1期細胞下降為41.97%(P＜0.01)，S期細胞上升為53.23%(P＜0.01)。與H2O2模型組相比，不同濃度黃芪甲苷預處理細胞后，G1期細胞分別恢復到46.72%(10 nmol·L－1組)和 50.39%(100 nmol·L－1組)，均高于模型組(P＜0.01);而S期細胞分別恢復到52.12%與49.02%，100 nmol·L－1黃芪甲苷組S期低于H2O2模型組(P＜0.01)，見Fig 7。結果提示:H2O2模型組細胞周期被阻滯在S期，加入高濃度黃芪甲苷后可以緩解此現(xiàn)象。

、2.5 黃芪甲苷能恢復H2O2對細胞周期蛋白Cyclin D1、A表達的影響 由于細胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin A參與調控細胞周期，黃芪甲苷是否通過調控Cyclin D1及Cyclin A的表達抑制細胞凋亡的發(fā)生?為了驗證這一假設，通過Western blot分析顯示，與對照組相比，H2O2模型組CyclinD1表達降低，而不同濃度黃芪甲苷預保護組及陽性對照組與模型組相比，均可以恢復Cyclin D1的表達(P＜0.01)(Fig 8A)，而對Cyclin A的表達則無影響(Fig 8B)。表明，黃芪甲苷對細胞周期的調控機制之一可能是通過上調由H2O2所致Cyclin D1表達的下降而發(fā)揮調控作用。

Fig 4 ASⅣinhibited H2O2-induced oxidative damage in PC12 cells by Hoechst 33258 stain

Fig 5 ASⅣprotected PC12 cells from injury induced by H2O2

2.6 黃芪甲苷抑制H2O2誘發(fā)的p38/MAPK信號通路的激活 為了進一步探討黃芪甲苷是否通過抑制H2O2誘發(fā)的PC12細胞p38/MAPK信號通路的激活，從而對PC12細胞起到保護作用。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，H2O2模型組磷酸化p38表達升高(Fig 9);而不同濃度黃芪甲苷預保護組與模型組相比，均能夠明顯降低磷酸化p38的表達(P＜0.01)。表明黃芪甲苷保護細胞氧化損傷的分子機制之一是:可以抑制H2O2誘發(fā)的PC12細胞p38/MAPK信號通路的激活。

3 討論

神經元進行性丟失是神經退行性疾病的一個主要病理特征，其中氧化應激在神經元凋亡過程中起主要作用［9］。神經元含有較豐富的對自由基敏感的多不飽和脂肪酸，易遭受自由基攻擊;且神經元內具有抗氧化活性的谷胱甘肽含量較低，使其清除自由基能力下降，以上因素進一步促進了神經元對氧化應激損傷的敏感性［10］。如何有效降低氧化應激對神經元的損傷已成為近年來治療神經退行性疾病的一個研究熱點。本實驗通過MTT法和流式細胞術檢測，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠提高H2O2損傷所致PC12細胞的細胞活力的降低，降低胞內由H2O2誘導的ROS的產量及細胞凋亡率。

Fig 6 The fluorescence value decreased after treating with ASⅣin PC12 cells induced by H2O2

Fig 7 Cell cycle assessment of PC12 cells by flow cytometry

Fig 8 Effects of AS Ⅳ on Cyclin D1(A)and Cyclin A(B)expressions of PC12 cells induced by H2O2.

近年來的研究表明，細胞凋亡與細胞增殖周期密切相關［11］，阻斷細胞增殖周期進程可以引起凋亡，并且凋亡也常伴隨細胞周期阻滯。Cyclin D1及Cyclin A是反應細胞周期變化的蛋白，參與調控細胞周期G1期到S期的轉變，可以加速細胞周期的進程［12－13］。本實驗通過流式檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠緩解H2O2對PC12細胞G0/G1期至S期的阻滯現(xiàn)象。為了進一步了解黃芪甲苷緩解細胞周期阻滯的機制，通過Western blot檢測各實驗組Cyclin D1及Cyclin A的蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，與模型組比較黃芪甲苷能夠上調細胞周期蛋白Cyclin D1的表達，而對Cyclin A的表達無影響。實驗結果提示:黃芪甲苷可能通過調控周期蛋白Cyclin D1的表達，從而影響細胞恢復正常增殖規(guī)律。

Fig 9 Effects of ASⅣon p38MAPK phosphorylation of PC12 cells induced by H2O2

p38/MAPK信號通路途徑廣泛參與了環(huán)境應激的應答、炎癥的調控及細胞的凋亡。越來越多的研究顯示［14－15］，p38/MAPK 信號通路途徑也參與了細胞增殖的正性與負性調節(jié)。黃芪甲苷可能通過調節(jié)p38/MAPK信號通路對細胞增殖發(fā)揮作用。本實驗為了進一步驗證此假設，通過 Western blot檢測p38/MAPK蛋白的磷酸化表達水平，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠抑制p38/MAPK信號通路的激活。有研究報道［16－17］，某些含有絲氨酸或蘇氨酸磷酸化位點的磷酸激酶通常也含有O-連接的糖基化(O-GlcNAc)位點。因此，磷酸化與糖基化的相互競爭可以對相應的激酶產生雙向調節(jié)作用，最終影響其在信號轉導中的作用。本實驗中黃芪甲苷是否通過調節(jié)OGT水平發(fā)揮作用還有待進一步的驗證。

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