Caco-2細(xì)胞對負(fù)載維生素D3的納米粒的攝入研究

高艷麗，劉 賽

(1.臨沂市沂水中心醫(yī)院臨床藥學(xué)科，山東 沂水 276400;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室山東 青島 266021)

為進(jìn)一步研究sSAN-FITC負(fù)載維生素D3后被Caco-2細(xì)胞的攝取情況，本實(shí)驗(yàn)采用激光共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)對sSAN-VD3-FITC被Caco-2細(xì)胞的攝取進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，分析影響攝取的多種因素，使攝取的過程更加直觀、可信。

在此基礎(chǔ)上采用Caco-2細(xì)胞吸收模型對sSANVD3-FITC進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究。因它能為Caco-2細(xì)胞提供類似于體內(nèi)的生長環(huán)境，當(dāng)Caco-2細(xì)胞形成單層之后，向腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與小腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能非常相似，其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)更加接近體內(nèi)吸收狀況。建立Caco-2細(xì)胞模型需要應(yīng)用Transwell，即跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)裝置。它的種類有多種，本實(shí)驗(yàn)選用懸掛式、內(nèi)側(cè)小室底部膜為孔徑0.4 μm的聚碳酯膜的Transwell，此種Transwell最適用于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究［1－2］。

跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測接受液的熒光強(qiáng)度，定量分析Caco-2細(xì)胞對藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)情況，以推測機(jī)體對sSAN-VD3的吸收、利用情況，進(jìn)一步評估應(yīng)用海藻酸鈉經(jīng)油酸改性后的兼性材料、根據(jù)分子自組裝原理所制備的納米粒，作為疏水性營養(yǎng)物質(zhì)載體的可行性。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞 Caco-2細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。本實(shí)驗(yàn)采用30～40代。

1.2 藥品與試劑 負(fù)載VD3的自組裝海藻酸鈉納米粒(sSAN-VD3，食品級，中國海洋大學(xué)生命科學(xué)部);異硫氰基熒光素(FITC，Amresco 0633，美國);鼠尾膠原蛋白Ⅰ型(杭州生友生物試劑有限公司，批號:20080515);熒光黃(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號:2007-01-02);4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，D212-10型，日本同仁化學(xué)研究所中國上海代理處);DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國，批號:1290007);胎牛血清(中美合資蘭州民海生物工程有限公司，批號:20071127);胰蛋白酶(Sigma，美國);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，青島海泰生物科技有限公司分裝，荷蘭，超高純);雙抗(青霉素，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號:S080148;鏈霉素，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號:070303);曲拉通(Amresco 0694，美國，Cat.No.T8200，試劑級)。

1.3 儀器 熒光酶標(biāo)儀(M5型，美國分子儀器公司);激光共聚焦顯微鏡(LSM510-Meta型，德國蔡司公司);Transwell(3401型，美國康寧公司，批號:31907011);Millicell-ERS電阻儀 (MERS00001型，Millipore，美國);CO2培養(yǎng)箱(Heraeus，德國赫利公司);超凈工作臺(AIR TECH，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，倒置顯微鏡(Olympus，奧林巴斯北京銷售)。

2 方法

Caco-2細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、雙抗)于37℃、5%CO2、相對濕度90%條件下培養(yǎng)至 90%匯合，備用［3－4］。

2.1 共聚焦顯微鏡下觀察Caco-2細(xì)胞對sSANVD3-FITC的攝入 調(diào)整Caco-2細(xì)胞密度至6×107·L－1，接種到細(xì)胞爬片上，每孔2 ml，培養(yǎng)至70%匯合。實(shí)驗(yàn)前2 h更換無血清、無雙抗的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)前30 min，用37℃Hanks液沖洗細(xì)胞3次，在不破壞細(xì)胞的前提下，盡量去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)［5］。用無血清、無雙抗的培養(yǎng)基溶解sSAN-VD3-FITC，設(shè)400 mg·L－1濃度組、空白對照組，孵育不同時間(1、4 h)后，用Hanks液沖洗，體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇固定15 min，再次沖洗。將細(xì)胞爬片放置在滴有DAPI的載玻片上，通過激光共聚焦顯微鏡觀察攝入情況［6］(FITC激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為521 nm;DAPI激發(fā)波長為358 nm，發(fā)射波長為461 nm)。

2.2 Caco-2細(xì)胞吸收模型對sSAN-VD3-FITC的攝入研究

2.2.1 Caco-2細(xì)胞吸收模型的建立

2.2.1.1 Transwell轉(zhuǎn)運(yùn)裝置的準(zhǔn)備 將 5 g·L－1的鼠尾膠原蛋白Ⅰ型用0.006 mol·L－1冰醋酸溶液稀釋成終濃度為0.0012 g·L－1的溶液，將其加入Transwell內(nèi)側(cè)小室的聚碳酯膜上［2，7－9］，每孔 200 μl，室溫下放置1 h后，用PBS緩沖液沖洗3次。

2.2.1.2 檢測跨細(xì)胞電阻(TEER) 在 Transwell內(nèi)、外側(cè)小室分別加入培養(yǎng)基0.5、1.5 ml，用Millicell-ERS電阻儀檢測電阻，均在170～185 Ω范圍內(nèi)。

2.2.1.3 接種及培養(yǎng)細(xì)胞 細(xì)胞接種于Transwell內(nèi)側(cè)小室內(nèi)，使細(xì)胞在聚碳酯膜上最終密度為7.5×104/cm2［1－2，4，9］，繼續(xù)培養(yǎng) 21 d。如 Fig 1 所示。

Fig 1 The conceptual diagram of transmembrane transport with Caco-2 cells model

2.2.2 細(xì)胞單層完整性檢測 培養(yǎng)21 d后，為了確定Caco-2細(xì)胞在Transwell內(nèi)側(cè)小室的聚碳酯膜上是否已生長成一單層連結(jié)致密的細(xì)胞層，細(xì)胞單層是否完整，采用細(xì)胞跨膜電阻測量和熒光黃透過實(shí)驗(yàn)兩種方法進(jìn)行檢測。

2.2.2.1 細(xì)胞跨膜電阻(TEER) 用Millicell-ERS電阻儀檢測各孔 TEER［3－4，7，9－11］。短電極放到內(nèi)側(cè)小室，長電極放到外側(cè)小室，檢測時不觸及內(nèi)側(cè)小室的底部，以免損壞聚碳酯膜上的Caco-2細(xì)胞單層。當(dāng)細(xì)胞單層的電阻＞600 Ω時，表明細(xì)胞單層是完整的。

2.2.2.2 熒光黃透過實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)［5］。在各孔內(nèi)側(cè)小室加100 mg·L－1的熒光黃溶液［7，10］0.5 ml，外側(cè)小室加 1.5 ml Hanks 液，培養(yǎng)2 h。用熒光分光光度計(jì)檢測外側(cè)小室接受液的熒光強(qiáng)度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定接受液及原溶液中熒光黃的含量，并計(jì)算熒光黃透過率:

當(dāng)2 h熒光黃透過率＜1%，則說明膜的完整性良好［2］。

2.2.3 sSAN-VD3-FITC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)前去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)［5］。用培養(yǎng)基溶解sSANVD3-FITC，濃度為 600 mg·L－1。

2.2.3.1 腸腔側(cè)(apica1，AP)-基底側(cè)(basolateral，BL)方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) 設(shè)sSAN-VD3-FITC組和空白對照組，每組3個復(fù)孔，sSAN-VD3-FITC組在Transwell內(nèi)側(cè)小室加藥0.5 ml，外側(cè)小室加培養(yǎng)基1.5 ml;空白對照組內(nèi)外側(cè)小室均加培養(yǎng)基。分別于0.5、1、2、4 h 于接受池內(nèi)取200μl液體，用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，并補(bǔ)充200 μl培養(yǎng)基［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測各孔的細(xì)胞跨膜電阻。

2.2.3.2 BL-AP方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同2.2.3.1，sSAN-VD3-FITC組在外側(cè)小室加藥1.5 ml，內(nèi)側(cè)小室加培養(yǎng)基0.5 ml;空白對照組的內(nèi)外側(cè)小室均加培養(yǎng)基。分別于0.5、1、2、4 h于接受池內(nèi)取100 μl液體，檢測其熒光強(qiáng)度，同時補(bǔ)充 100 μl培養(yǎng)基［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測各孔的細(xì)胞跨膜電阻。

3 結(jié)果

3.1 共聚焦顯微鏡 如Fig 2～5所示。

3.2 細(xì)胞單層完整性檢測結(jié)果

3.2.1 細(xì)胞跨膜電阻(TEER)12孔板的各孔電阻均＞880 Ω，減掉未接種細(xì)胞時的電阻后，所測得的各孔的細(xì)胞跨膜電阻(TEER)均＞600 Ω，符合跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的要求［3－4，7，10－11］。

3.2.2 熒光黃透過實(shí)驗(yàn) ① 熒光黃直線回歸方程為Y=－18.804+926.477X(r=0.9999)測得接受液的熒光強(qiáng)度最高為254.4，2 h最高通過量為0.442 μg，原熒光黃溶液濃度為 100 mg·L－1，按下式計(jì)算:

得2 h熒光黃透過率為0.885%，＜1%說明膜的完整性良好，符合跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)要求［2］。

3.3 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 AP-BL方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) 與空白對照組相比，sSAN-VD3-FITC在Transwell內(nèi)側(cè)小室與Caco-2細(xì)胞作用不同時間(0.5、1、2、4 h)后，外側(cè)小室內(nèi)接受液的熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)(P＜0.05);作用4 h后接受液的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)(與作用0.5、1、2 h比較，P＜0.05)。

3.3.2 BL-AP方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) 與空白對照組相比，sSAN-VD3-FITC在Transwell外側(cè)小室與Caco-2細(xì)胞作用不同時間(0.5、1、2、4 h)后，內(nèi)側(cè)小室內(nèi)接受液的熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)(P＜0.01);作用2 h后接受液的熒光強(qiáng)度較作用0.5 h明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，較作用1h熒光強(qiáng)度也有所增強(qiáng)(P＜0.05);作用4 h后熒光強(qiáng)度最強(qiáng)(與作用0.5、1、2 h比較，P＜0.05)。

3.3.3 累積通過量 據(jù)直線回歸方程Y=97.798+433.394X，求得接受液內(nèi)藥物濃度，即可得到接受液內(nèi)藥物的含量，即藥物的累積跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量ΔQ。

Fig 2 Picture of control group of sSAN-VD-FITC absorption study taken by LSCM

Fig 3 Nucelus dyed by DAPI control group of sSAN-VD3-FITC absorption study taken by LSCM

Fig 4 Picture of sSAN-VD3-FITC incubated with Caco-2 cells for 1h taken by LSCM

AP-BL方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，與空白對照組相比，sSAN-VD3-FITC與Caco-2細(xì)胞作用不同時間(0.5、1、2、4 h)后，接受液內(nèi)藥物的含量明顯增加(P＜0.05);作用4 h后接受液內(nèi)的藥物含量最多(與作用0.5、1、2 h比較，P＜0.05)。結(jié)果顯示，sSAN-VD3-FITC由AP-BL方向通過Caco-2單層的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)隨著孵育時間的延長而逐漸增加，呈現(xiàn)時間依賴性。

BL-AP方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，與空白對照組相比，sSAN-VD3-FITC與Caco-2細(xì)胞作用不同時間(0.5、1、2、4 h)后，接受液內(nèi)藥物的含量均明顯增加(P＜0.01);作用2 h后接受液的藥物含量較作用0.5、1 h明顯增加(P＜0.05);作用4 h后細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量最高(與作用0.5、1、2 h比較，P＜0.05)。如 Tab 1所示。

3.3.4 表觀滲透系數(shù)(The apparent permeability coefficient，Papp)［2］:

AP-BL方向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp較穩(wěn)定，且隨著作用時間的延長逐漸減小，BL-AP方向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp先上升后下降。提示sSAN-VD3-FITC的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)存在飽和現(xiàn)象，可能受載體介導(dǎo)。如Fig 6所示。

3.3.5 表觀滲透率 PDR P(BL-AP)為藥物從BL到AP的表觀滲透系數(shù)，P(AP-BL)為藥物從AP到BL的表觀滲透系數(shù)。如Tab 2所示。

Tab 1 The time influence on the quantity of sSAN-VD3-FITC transport(±s，n=3)

Tab 1 The time influence on the quantity of sSAN-VD3-FITC transport(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 4 h group

Time AP-BL/μg BL-AP 0.5 h 0.291 ±0.077＊＊ 0.384 ±0.09＊＊1 h 0.515 ±0.175＊＊ 0.874 ±0.043＊＊2 h 0.920 ±0.345* 4.897 ±1.713*4 h 1.791 ±0.571 8.822 ±2.860

Tab 2 The PDR of sSAN-VD3-FITC transport over time

4 討論

在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，Caco-2細(xì)胞模型的建立非常關(guān)鍵，其中包括Transwell轉(zhuǎn)運(yùn)裝置的種類的選擇、Caco-2細(xì)胞的接種、接種后細(xì)胞生長情況的檢測、及模型制作完成后細(xì)胞單層完整性的判斷等。

本實(shí)驗(yàn)選用的是內(nèi)側(cè)小室底部材料為聚碳酯膜的 Transwell，材料的孔徑為 0.4 μm［1－2］，此裝置被廣泛應(yīng)用于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究。在細(xì)胞接種前對Transwell轉(zhuǎn)運(yùn)裝置的處理，即成功地將鼠尾膠原蛋白涂在Transwell內(nèi)側(cè)小室底部的聚碳酯膜上，是成功建立模型的前提。鼠尾膠原蛋白Ⅰ型能夠促進(jìn)Caco-2細(xì)胞貼壁，無菌、適宜濃度的鼠尾膠原蛋白Ⅰ型的配制是制作模型過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。因鼠尾膠原蛋白Ⅰ型在室溫下遇空氣易凝固，配置溶液時應(yīng)盡量在低溫條件下進(jìn)行，且動作應(yīng)迅速，耗時不可過長。接種的細(xì)胞數(shù)量是關(guān)鍵，細(xì)胞數(shù)量太少，細(xì)胞很難匯合，且生長緩慢;細(xì)胞數(shù)量太多，容易發(fā)生擁擠、重疊等，不容易形成單層，影響藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的效果。此外，細(xì)胞接種成功后，對細(xì)胞的生長情況需要嚴(yán)密觀測，通過倒置顯微鏡觀察、檢測細(xì)胞跨膜電阻(TEER)等方法進(jìn)行檢測。細(xì)胞生長21 d后，形成完整的細(xì)胞單層是保證跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。檢測方法有很多:①倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的融合情況:細(xì)胞已完全融合，細(xì)胞緊密連接在一起，細(xì)胞之間無空隙。② 電鏡切片觀察:細(xì)胞間的緊密連接和橋粒的形成、微絨毛形成，證明細(xì)胞單層致密，Caco-2細(xì)胞已成功轉(zhuǎn)換為腸上皮細(xì)胞。③酚紅透過率實(shí)驗(yàn):(波長為560 nm)測定其酚紅吸光度(D)，p酚紅透過/%=D下層/D總×100%，D總為加入酚紅的吸光度值［13］。④3H或14C甘露醇透過率實(shí)驗(yàn):Papp＜1×10－6cm·s－1［14］，說明膜是完整的。⑤ 檢測細(xì)胞跨膜電阻(TEER):Millicell-ERS檢測細(xì)胞TEER，能夠定性反映細(xì)胞的健康狀況，并定量反映細(xì)胞的融合程度，對細(xì)胞幾乎無損傷，是檢測Caco-2細(xì)胞模型完整性最常用的指標(biāo)。⑥熒光黃透過率檢測:是胞旁通路的標(biāo)志物，其透過率檢測結(jié)果2 h累積透過率＜1%，說明細(xì)胞之間已經(jīng)形成緊密連接，細(xì)胞單層的完整性良好，符合跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的要求［2］。

Fig 5 Picture of sSAN-VD3-FITC incubated with Caco-2 cells for 4h taken by LSCM

Fig 6 Transport of sSAN-VD3-FITC over time

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sSAN-VD3-FITC可以進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并且AP-BL、BL-AP方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量均隨著孵育時間的延長而逐漸增加，呈現(xiàn)時間依賴性。但從表觀滲透系數(shù)來看，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)呈現(xiàn)很強(qiáng)的有向性，AP-BL的轉(zhuǎn)運(yùn)速率減慢，而BL-AP的轉(zhuǎn)運(yùn)速率增大，由此推測sSAN-VD3-FITC的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)可能受Caco-2細(xì)胞單層AP端細(xì)胞膜上P-gp的影響，它將細(xì)胞內(nèi)的sSAN-VD3-FITC作為底物排出細(xì)胞外，AP-BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)是受P-gp外排的負(fù)向作用，起到降低轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，而BL-AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)可能是受P-gp的正向作用，起促進(jìn)作用。因此AP-BL的轉(zhuǎn)運(yùn)速率減慢，而BL-AP的轉(zhuǎn)運(yùn)速率增大，而BL-AP的轉(zhuǎn)運(yùn)速率于2h達(dá)高峰，后呈下降趨勢，說明存在飽和現(xiàn)象。吸收良好的藥物的表觀滲透系數(shù)Papp＞10－6cm·s－1;吸收為1% ～100%的藥物表觀滲透系數(shù) Papp為0.1×10－6～1×10－6cm·s－1;而吸收差的藥物(即吸收 ＜1%)的 Papp＜10－7cm·s－1［15］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示 Papp 在 0.1 ×10－6～1×10－6范圍內(nèi)，因此吸收為1% ～100%。但是這一相關(guān)關(guān)系主要適用于被動轉(zhuǎn)運(yùn)，對于吸收差的藥物，Caco-2細(xì)胞模型只能作為體內(nèi)吸收的一個定性而非定量指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道在Caco-2細(xì)胞模型中吸收差的藥物的透過速度是其在人的空腸中透過速度的3.33% ～1.25%，其可能原因是Caco-2細(xì)胞模型中緊密連接的滲透性比正常小腸上皮小，在體內(nèi)擴(kuò)散距離加長［15］。因此，sSAN-VD3在體內(nèi)的吸收分?jǐn)?shù)可能會比試驗(yàn)結(jié)果有所升高，這有待于體內(nèi)藥代動力學(xué)的進(jìn)一步研究。

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