組織相容性Ⅰ類相關(guān)鏈A位點(diǎn)基因多態(tài)性在預(yù)判腎移植物排斥中的意義

袁曉妮 何軍 侯建全 溫端改 鮑曉晶 邱橋成 王乾 鐘鍵 李強(qiáng)

近年來(lái)在無(wú)人類白細(xì)胞抗原( human leukocyte antigen,HLA )錯(cuò)配的腎移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的患者血清中檢測(cè)到主要組織相容性Ⅰ類相關(guān)鏈A位點(diǎn)(MHC class I chain related antigens A,MICA)抗體[1-2]，并且在一些等待腎移植的終末期腎病患者血清中也檢測(cè)到抗 MICA 抗體[3]。移植術(shù)后受者 MICA 基因多態(tài)性的頻率增加和抗 MICA 抗體水平均與移植排斥相關(guān)。因而，對(duì) MICA 分子的研究受到中外學(xué)者的廣泛關(guān)注。由于MICA 分子表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，而不表達(dá)在外周血淋巴細(xì)胞，并且 MICA分子作為配體與NK細(xì)胞的激活性受體 NKG2D結(jié)合在先天免疫中發(fā)揮重要作用[4]。因此，MICA分子在腎移植中無(wú) HLA 抗體而發(fā)生急性和慢性排斥反應(yīng)發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[2,4]。本研究在延續(xù)前期研究的基礎(chǔ)上，著重探討利用 MICA 基因多態(tài)性預(yù)判腎移植術(shù)前預(yù)存和移植術(shù)后新生抗MICA 抗體在排斥反應(yīng)發(fā)生中的意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、對(duì)象

動(dòng)態(tài)分析2006年12月至2009年3月在我院接受檢查的尸體或親緣活體供腎的腎移植患者共40例，其中尸體供腎為35例，親緣活體供腎5例。男性29例，女性11例。每例受者均在移植術(shù)前和移植術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年和2年以上的隨訪時(shí)間點(diǎn)收取樣本，所有標(biāo)本收集后放至-80℃冰箱保存，隨訪截止時(shí)間為2009年3月。另取10名正常志愿者為對(duì)照組。

二、MICA 基因分型

采用序列特異性寡核苷酸探針( PCR-SSOP )基因分型方法( 美國(guó)One Lambda公司)，擴(kuò)增條件為： 96℃變性2min，以96℃ 10 s、63℃ 60 s為1個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，再以96℃ 10 s、59℃ 50 s、72℃ 30 s為1個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)。MICA基因型分為：MICA*001，002/020，004，005，006，007/026，008，009/049，010，011，012，013，014，015，016/019，017，018，021，022，023，024，025，027，028，029，030，031，032，033，034，035，036，037/039，038，040～053。

三、抗 MICA 特異性抗體的分析

采用免疫磁珠液相芯片技術(shù)進(jìn)行抗 MICA 抗體的篩選和特異性抗體檢測(cè)( One Lambda公司)。血清樣本檢測(cè)對(duì)應(yīng)的 MICA 等位基因是MICA*001，MICA*002，MICA*004，MICA*007，MICA*009，MICA*012，MICA*017，MICA*018，MICA*019，MICA*027，MICA*027 和MICA*008 有相同的氨基酸序列。每一種 MICA 等位基因包被珠子的熒光信號(hào)用 Luminex 200 流式細(xì)胞儀檢測(cè)和HLA-Fusion 軟件分析。每次實(shí)驗(yàn)均有陰性和正常血清，當(dāng)珠子的熒光信號(hào)超過(guò) cut-off 閾值時(shí)判斷為抗 MICA 抗體陽(yáng)性?？?MICA 特異性抗體陽(yáng)性分值的判斷標(biāo)準(zhǔn)： 1分陰性；2分為可疑陽(yáng)性；4分為弱陽(yáng)性；6分為陽(yáng)性；8分為強(qiáng)陽(yáng)性。

四、MICA 基因具有相同抗原表位的特征性分組

把 MICA 基因多態(tài)性具有共同的抗原決定簇歸入為一組，分為MICA-G1組和MICA-G2組。MICA-G1組包括 MICA*001、 MICA*012、MICA*018、MICA*007、MICA*002和MICA*017；MICA-G2組包括 MICA*004、MICA*006、MICA*009、MICA*008和MICA*019。MICA-G1組相對(duì)應(yīng)的抗 MICA 抗原為：MICA-1、MICA-12、MICA-18、MICA-7、MICA-2和MICA-17；MICA-G2組相對(duì)應(yīng)的抗MICA抗原為： MICA-4、MICA-6、MICA-9、MICA-8和MICA-19。

五、HLA 抗體的篩選

所有的受者均采用LAB Screen?kit (One Lambda公司) 篩選和鑒定。HLA-Ⅰ特異性抗體檢測(cè)包括HLA-A、HLA-B和HLA-Cw；HLA-Ⅱ特異性抗體檢測(cè)包括HLA-DRB1、HLADQB1和HLA-DPB1，特異性抗體百分率≥10﹪為陽(yáng)性。

六、血清肌酐(serum creatinine,SCr)檢測(cè)采用酶法檢測(cè)水平，正常值為44.2～104.0 μmol/L。

結(jié) 果

一、移植術(shù)前預(yù)存抗 MICA 抗體的分析

在 40例受者中移植術(shù)前預(yù)存抗 MICA 抗體陽(yáng)性 12例，占30.0﹪(12/40)，其中 MICA 抗體10例，抗 HLA-Ⅰ類抗體和MICA 抗體均陽(yáng)性 2例，抗 HLA 抗體陽(yáng)性3例。33例受者均在移植術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年和2 年接受動(dòng)態(tài)隨訪，失訪2例，肺部感染死亡1例，腎失活切除 2例，2例移植術(shù)前預(yù)存 HLA 抗體均失功。

二、MICA 基因頻率的特征性分組

12例移植術(shù)前預(yù)存抗MICA抗體陽(yáng)性受者分為MICA-G1組4例，MICA-G2組6例，共為MICA-G1和G2組2例。在MICA-G1組的基因頻率分布從高到低為： MICA*002、MICA*001、MICA*018、MICA*007、MICA*017。在 MICA-G2組的基因頻率分布從高到低為：MICA*004、MICA*008、MICA*019、MICA*009(表1)。移植術(shù)前預(yù)存抗MICA抗體中均未見(jiàn)MICA*012 和MICA*006。

三、移植術(shù)前供受者 MICA 基因分型和基因頻率分布

在接受動(dòng)態(tài)隨訪的 33例受者中有 16 對(duì)供受者均進(jìn)行了 MICA 和HLA 基因分型。在 5 對(duì)親緣腎移植中的供受者 MICA 和HLA 基因分型為 2 對(duì)全相合和3 對(duì)半相合；在11對(duì)尸體腎移植中的供受者M(jìn)ICA和HLA基因分型為3對(duì)半相合，8對(duì)均為不相合(表2)。16對(duì)供受者M(jìn)ICA 等位基因頻率分布為 ： M*010(0.27)、M*008(0.14)、M*002(0.125)、M*009(0.11)、M*016/019、M*007(0.078)、M*004、M*027、M*033(0.05)和M*017(0.03)。在 MICA-G1組中頻率M*002最高，M*007次之，M*017最低，M*012和M*018未見(jiàn)。MICA-G2組中頻率M*008最高，M*009和M*019次之，M*004最低，M*006未見(jiàn)。

四、動(dòng)態(tài)隨訪中 MICA 抗體的特異性和新生抗體的分析

33例受者在移植術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年和2 年時(shí)間點(diǎn)上接受動(dòng)態(tài)隨訪中有 7例產(chǎn)生了新生抗體，新生抗體率為21.2﹪。10例移植術(shù)前預(yù)存抗MICA抗體中3例移植術(shù)后新生抗MICA抗體分別為抗供者的特異性抗體( donor-specific antibody,DSA )和非供者特異性抗體( non-donor-specific antibody,NDSA )，新生抗體的時(shí)間為3個(gè)月和1年不等；1例在移植術(shù)后6個(gè)月新生抗 HLA-Ⅰ類抗體和移植術(shù)后2年新生抗HLA-Ⅱ類抗體；2例移植術(shù)前預(yù)存抗 HLA-Ⅰ類和MICA 抗體移植術(shù)后3個(gè)月新生抗HLA-Ⅰ類抗體；1例移植術(shù)前抗體陰性移植術(shù)后1個(gè)月新生MICA的DSA和NDSA抗體(表2)。另外6例移植術(shù)前預(yù)存抗 MICA 抗體的受者，動(dòng)態(tài)隨訪期間檢測(cè)抗 MICA 抗體的特異性類型均無(wú)改變，抗體的陽(yáng)性分值呈現(xiàn)高低的波動(dòng)性，并且1～2年后抗 MICA 抗體陽(yáng)性均升高達(dá)到甚至超過(guò)移植術(shù)前的水平(圖1～3)。

表1 移植術(shù)前受者預(yù)存 MICA 抗體的特征性分組

圖1 動(dòng)態(tài)隨訪2年中MICA-G1組患者的抗MICA抗體的變化

圖2 動(dòng)態(tài)隨訪2年中MICA-G2組患者的抗MICA抗體的變化

圖3 動(dòng)態(tài)隨訪3個(gè)月中同時(shí)具有MICA-G1和MICA-G2組患者的抗MICA抗體的變化

1例移植術(shù)前抗體陰性的受者在移植術(shù)后7 d出現(xiàn)排斥反應(yīng)，從術(shù)前、術(shù)后7 d和術(shù)后15 d檢測(cè)抗 MICA 抗體均為陰性，至術(shù)后1個(gè)月出現(xiàn)抗MICA 抗體陽(yáng)性，特異性抗體為MICA-1、MICA-12、MICA-18、MICA-7、MICA-2、MICA-17、MICA-8和MICA-19；術(shù)后 2個(gè)月特異性抗體為MICA-18、MICA-7、MICA-2、MICA-17、MICA-8 和MICA-19，抗體的陽(yáng)性分值逐漸下降。

五、抗 MICA 抗體與排斥反應(yīng)和移植腎功能的相關(guān)性分析

在動(dòng)態(tài)隨訪中 4例移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)，5號(hào)受者移植術(shù)前Scr 1079 μmol/L，移植術(shù)后7 d尿量減少為1267ml，Scr 647 μmol/L下降緩慢，且患者腹脹明顯，用強(qiáng)的松、驍悉和雷帕鳴三聯(lián)免疫治療后尿量為 3305ml，Scr 456 μmol/L；移植術(shù)后 2 個(gè)月 Scr 92 μmol/L，改為強(qiáng)的松、驍悉和FK506 三聯(lián)免疫治療；移植術(shù)后1年新生 DSA 和NDSA 的 MICA 抗體。13 號(hào)受者腎移植術(shù)后 1 個(gè)月余無(wú)明顯誘因的情況下突然出現(xiàn)發(fā)熱，最高達(dá) 39℃并有乏力，日尿量 2300ml，Scr 207 μmol/L，尿素氮（blood urea nitrogen,BUN） 11.7mmol/L，術(shù)后維持MMF+Pred+新賽斯平，改為 FK506，以后每1個(gè)月左右發(fā)熱 1次伴白細(xì)胞升高，移植術(shù)后1年新生 DSA 和NDSA 的抗 MICA 抗體。16 號(hào)受者移植術(shù)后 1.5 個(gè)月，無(wú)明顯誘因的情況下出現(xiàn)發(fā)熱，最高 40℃度，略感尿量減少，Scr 171 μmol/L，BUN 21.8mmol/L，給以 MMF和FK506 等免疫抑制劑治療后癥狀好轉(zhuǎn)；移植術(shù)后 3 個(gè)月新生 NDSA 的 HLA 抗體。32 號(hào)受者移植術(shù)前抗體陰性，Scr 675 μmol/L，移植術(shù)后 5 d Scr 下降至 133 μmol/L，用強(qiáng)的松、驍悉和FK506 三聯(lián)免疫治療，移植術(shù)后 10d Scr升高到 222 μmol/L，臨床診斷排異；移植術(shù)后 21d Scr 206 μmol/L并出現(xiàn)腹瀉，改用強(qiáng)的松、MIZ和FK506 三聯(lián)免疫治療；移植術(shù)后 1 個(gè)月出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，Scr 升高到 425 μmol/L 并且檢測(cè)到 MICA 抗體陽(yáng)性。4例發(fā)生排斥反應(yīng)受者的MICA 等位基因、抗體類型與排斥反應(yīng)的臨床表現(xiàn)（表3）。

表3 MICA 等位基因、抗體類型與排斥反應(yīng)的臨床表現(xiàn)

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腎移植術(shù)前受者預(yù)存抗 MICA 抗體為30﹪(12/40)，這與國(guó)外的研究報(bào)道預(yù)存抗MICA抗體為11.4﹪[2]和18.6﹪～24.7﹪較一致[5]，移植術(shù)前預(yù)存抗MICA抗體而引起急性排斥反應(yīng)的比例為25.0﹪(3/12)。腎移植術(shù)前受者預(yù)存抗MICA抗體可引起急性排斥反應(yīng)，移植術(shù)后1年的存活率明顯低于抗MICA抗體陰性者，抗MICA抗體與移植術(shù)后存活率的降低更密切相關(guān)[2-3]。本課題組對(duì)腎移植術(shù)前預(yù)存抗MICA抗體的受者都進(jìn)行了抗供者的特異性抗體鑒定，對(duì)供受者進(jìn)行了MICA基因分型，移植術(shù)前已明確供者無(wú)針對(duì)受者的特異性MICA抗原。雖然受者預(yù)存抗MICA抗體，臨床判定為高危險(xiǎn)級(jí)別移植，但移植術(shù)后即使發(fā)生急性排斥反應(yīng)都經(jīng)過(guò)臨床及時(shí)治療后得到了很好的控制，隨訪中受者移植腎功能良好，但仍需進(jìn)一步隨訪研究。國(guó)外有研究認(rèn)為，抗MICA抗體與不可逆腎移植排斥反應(yīng)相關(guān)[6]，抗MICA抗體不僅與急性排異存在明顯相關(guān)性[1,5]，而且抗MICA抗體的持續(xù)存在也與慢性移植腎失功有關(guān)[7]。因此，抗MICA抗體與同種異體腎移植物排斥反應(yīng)有關(guān)應(yīng)引起我們的高度重視。

腎移植術(shù)后新生抗MICA和HLA抗體可以是DSA和NDSA[8-9]，而本實(shí)驗(yàn)組中新生的抗MICA和抗HLA抗體也存在DSA和NDSA類型，并且有1例移植術(shù)前抗體陰性移植術(shù)后1個(gè)月新生抗MICA抗體，這在國(guó)內(nèi)外研究中均未見(jiàn)報(bào)道。迄今國(guó)外也很少有MICA基因分型對(duì)研究MICA基因錯(cuò)配產(chǎn)生的抗體是直接針對(duì)供者還是針對(duì)自己的錯(cuò)配的研究報(bào)道[7]，我們認(rèn)為供受者的MICA基因錯(cuò)配是產(chǎn)生新生抗體的主要原因，并且錯(cuò)配的MICA基因處于具有相同抗原表位的特征性分組中就會(huì)引起交叉免疫反應(yīng)誘導(dǎo)了抗體的產(chǎn)生。MICA-G1組中的MICA-1-12-18-7-2-17分子在α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域中分別只存在36、173、206、210和215位氨基酸序列不同；MICA-G2組中的MICA-4-6-9-8-19分子在α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域中分別只存在206、210和215位氨基酸序列中不同[10]，而容易產(chǎn)生交叉抗體。但本組資料中還顯示移植術(shù)前預(yù)存抗體的受者可新生抗MICA或HLA抗體，我們認(rèn)為產(chǎn)生抗體的機(jī)制是MICA和HLA分子同處于6號(hào)染色體的2區(qū)1號(hào)帶，并且與HLA-B、C位點(diǎn)最靠近。因此，新生的抗體類型是否會(huì)變得更復(fù)雜還有待于進(jìn)一步觀察，對(duì)于本組研究中部分病例我們將進(jìn)一步采用MICA基因DNA測(cè)序的方法明確移植術(shù)后新生抗體的類型。

目前的研究已明確 MICA 有61個(gè)等位基因，10 種抗體類型，根據(jù) MICA 的基因多態(tài)性把具有共同的抗原決定簇歸入為一組對(duì)研究抗 MICA 抗體非常重要[10]。本組資料顯示無(wú)論是受者預(yù)存抗體還是基因分型中的基因頻率顯示：在 MICA-G1組中M*002和M*001頻率最高；MICA-G2組中M*008和M*004頻率最高，但 M*012和M*006均未見(jiàn)這種基因型，這與國(guó)外報(bào)道在心臟移植中的抗體頻率類同[11]。我們的研究還提示：部分移植術(shù)前預(yù)存抗MICA抗體經(jīng)隨訪后并未增加抗體類型，1～2年后抗MICA 抗體陽(yáng)性分值均升高到甚至超過(guò)移植術(shù)前的水平，我們認(rèn)為可能的原因?yàn)椋篗ICA基因α1和α2可形成抗原結(jié)合槽樣結(jié)構(gòu)，但其僅能容納小于3～4個(gè)氨基酸殘基，這提示MICA不能隨意結(jié)合抗原肽[12]。因此，研究中國(guó)人群的 MICA 基因頻率分布特點(diǎn)對(duì)清除或特異性吸附受者預(yù)存抗MICA 抗體有重要的應(yīng)用價(jià)值，特別是對(duì)一些抗體高滴度的致敏性受者可降低移植的風(fēng)險(xiǎn)，提高移植術(shù)后帶腎存活率具有非常重要的意義。

無(wú)論是 MICA 基因頻率分布特點(diǎn)，還是MICA 特異性抗體類型與排斥反應(yīng)的關(guān)系，本研究均顯示M*002、M*004、M*008、M*019和M*001基因型最常見(jiàn)，這與國(guó)外報(bào)道M*019、M*001和M*008 相一致[7]。目前常規(guī)使用的免疫抑制劑可降低抗 MICA 抗體的表達(dá)，但是無(wú)法清除抗MICA 抗體[13]。如能特異性免疫吸附 MICA 抗體，這將是本課題組今后的研究方向。因此，移植術(shù)前分析供受者的 MICA 基因分型并進(jìn)行特征性分組和受者抗 MICA 抗體的特異性鑒定；移植術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)抗 MICA 抗體的變化，特別是對(duì)無(wú)HLA 抗體的受者，尤其是親緣間的活體腎移植，是移植術(shù)后預(yù)防急性和慢性移植物排斥的重要靶分子。

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