超高效液相色譜測定鋁脅迫下水培毛竹根系分泌物中有機(jī)酸

劉穎坤，蔡莎藝，喻衛(wèi)武，冷華南，桂仁意

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省湖州市林業(yè)局，浙江 湖州 313000）

毛竹Phyllostachys pubescens可以隔年連續(xù)采伐及永續(xù)利用，生長速度快，經(jīng)濟(jì)用途非常廣泛，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的重要來源［1］。鋁不是植物必需的營養(yǎng)元素，微量的鋁（3～13 mg·L－1）可以刺激一些植物的生長，質(zhì)量濃度偏高便會(huì)發(fā)生毒害作用［2］。鋁的毒害是酸性土壤限制作物產(chǎn)量的主要因子之一［3］。土壤中的鋁多數(shù)通常以硅酸鹽態(tài)或氧化態(tài)存在，對(duì)植物沒有毒害作用［4］。當(dāng)土壤的酸堿度低于pH 5.0時(shí)，鋁的可溶性狀態(tài)便會(huì)增強(qiáng)，形成 Al3+，Al（OH）2+和 Al（OH）2+等離子，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用［5］?，F(xiàn)行的集約經(jīng)營方式使得浙江省的毛竹林地酸堿度低至pH 4.8左右［6］，已有明顯導(dǎo)致土壤鋁活化的趨勢［7］。因此，對(duì)毛竹鋁脅迫方面的研究在當(dāng)前具有較強(qiáng)的實(shí)際意義。在植物根系分泌物中最常見的有機(jī)酸有：檸檬酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸和丙二酸等，它們的測定方法通常有高效液相色譜法［8］和毛細(xì)管電泳法［9］等。這類物質(zhì)在植物中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的功效，能活化和固定植物根際潛在的養(yǎng)分［10］，并且植物根系在鋁脅迫下分泌有機(jī)酸被認(rèn)為是植物重要的耐鋁機(jī)制之一［11］。小麥Triticum aestivum，水稻Oryza sativa等植物的根系分泌有機(jī)酸的研究比較詳細(xì)［10，12－14］，但毛竹根系分泌物中有機(jī)酸方面的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用水培法培養(yǎng)毛竹種子2～3周；用ACQUITYTMUltra Performance LC超高效液相色譜系統(tǒng)，以體積分?jǐn)?shù)為 3%的甲醇-磷酸二氫鉀（0.01 mol·L－1）（pH 2.6）溶液作流動(dòng)相，經(jīng) HSS T3 C18柱分離，選取前述植物根系分泌物中最常見的 4種有機(jī)酸為研究組分，考察流動(dòng)相的 pH值及分離溫度等因素對(duì)草酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸4種有機(jī)酸分離效果的影響。本研究所建立的方法精密度、準(zhǔn)確度和再現(xiàn)性均符合痕量組分測定的要求，并且具有樣品用量少，分析速度快等特點(diǎn)，用于鋁脅迫時(shí)植物根系分泌物中有機(jī)酸的分析與研究，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

ACQUITYTMUltra Performance LC超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司），包含二元溶劑管理器、樣品管理器、柱溫箱和光電二陣管陣列檢測器，ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；Milli-Q超純水裝置；循環(huán)水式真空泵（中國河南鞏義市峪華儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（中國上海亞榮生化儀器廠），人工氣候箱（中國寧波萊?？萍加邢薰荆?，高壓滅菌鍋（日本三洋電器有限公司），酸度計(jì)，鑷子，培養(yǎng)皿等。

供試的毛竹種子于2006年采自廣西桂林市；采后存放于密封袋，于4℃冰箱中保存。草酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸對(duì)照品（色譜純，中國上海君創(chuàng)生物科技有限公司），甲醇（色譜純，美國TEDIA公司），試驗(yàn)用水為超純水，氫氧化鈉，鹽酸等試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)為 3%的甲醇-磷酸二氫鉀（0.01 mol·L－1）（pH 2.6）流速為 0.15 mL·min－1的等度洗脫，分析時(shí)間為 6 min，柱溫為 30 ℃，檢測波長為 210 nm，進(jìn)樣體積為 5.0 μL。

1.3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及試驗(yàn)中其他溶液的配制

精確稱量草酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸對(duì)照品各11 mg，用超純水溶于5 mL容量瓶得質(zhì)量濃度2.2 g·L－1草酸溶液為作為對(duì)照品母液，然后稀釋10倍得0.22 g·L－14種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣5.0，2.5，1.0，0.5，0.1 μL做4種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

配制 0，100，500，1 000，2 000 μmol·L－1氯化鋁溶液（用氫氧化鈉溶液或鹽酸調(diào)酸堿度至 pH 4.5）；2.0 g·kg－1的高錳酸鉀，1 mol·L－1氫氧化鈉溶液，1 mol·L－1鹽酸，體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇水溶液等。

1.4 樣品的準(zhǔn)備和處理

①在2.0 g·kg－1的高錳酸鉀中消毒0.5 h，常溫下在溫水中浸泡24 h。②分別采用0，100，500，1 000，2 000 μmol·L－1等5種不同濃度氯化鋁溶液作為培養(yǎng)液，各濃度下采用5個(gè)培養(yǎng)皿（內(nèi)置濾紙2片·培養(yǎng)皿－1，并高溫滅菌），加培養(yǎng)液20 mL·培養(yǎng)皿－1，用鑷子（經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒）分散放入30顆飽滿的種子。然后將培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中（28℃左右，濕度80%左右）。③隔3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周，合并同一試驗(yàn)單元下5個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至2 mL左右，用超純水定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜后作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的確定 為了考察檢測波長對(duì)有機(jī)酸檢測靈敏度的影響，用光電二極管陣列檢測器在190～400 nm（紫外）下采集4種有機(jī)酸的紫外吸收光譜圖，4種有機(jī)酸均在210 nm附近有較大的吸收，重復(fù)性好，不易受流動(dòng)相中其他物質(zhì)的干擾，故以下實(shí)驗(yàn)均采用210 nm波長進(jìn)行檢測。

2.1.2 色譜柱的選擇 本實(shí)驗(yàn)所用的色譜柱在美國Waters公司的BEH C18色譜柱、BEH Shield C18色柱、HSS T3 C18色譜柱，小分子有機(jī)酸極性比較大，多數(shù)做小分子有機(jī)酸的文獻(xiàn)都是用純水相作為流動(dòng)相。前2種UPLC柱都不可以用純水相洗脫，且無法將4種有機(jī)酸分離。因此，我們選擇專門用于做極性較大的成分，可以用純水相洗脫的HSS T3 C18色譜柱。

2.1.3 流動(dòng)相的選擇 有機(jī)酸為弱酸，在水系流動(dòng)相易解離，故采用抑制電離的方法，使它們變?yōu)榉肿討B(tài)的酸在柱子上保留而得到分離。本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相在硫酸、甲酸、磷酸二氫鉀之間選擇。硫酸是強(qiáng)酸，不適合作流動(dòng)相的改性劑；用2.0 g·kg－1的甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，基線漂移，且在目標(biāo)峰附近出現(xiàn)倒峰。磷酸鹽緩沖溶液作為一種弱酸電離抑制劑在紫外區(qū)幾乎無吸收，用其作為測定有機(jī)酸的流動(dòng)相有利于有機(jī)酸的分離而不影響檢測。由于較高濃度的鹽緩沖溶液對(duì)泵和柱子都有影響，而較低濃度的鹽緩沖溶液又對(duì)分離有影響，故選擇0.01 mol·L－1的磷酸二氫鉀緩沖溶液作流動(dòng)相的主要成分。

2.1.4 流動(dòng)相 pH值的選擇 以不同pH值（用磷酸調(diào)節(jié)）的0.01 mol·L－1的磷酸二氫鉀溶液作流動(dòng)相，測定各有機(jī)酸的保留時(shí)間。結(jié)果顯示，流動(dòng)相pH值對(duì)有機(jī)酸的分離影響很大。當(dāng)pH 2.0時(shí)，琥珀酸和檸檬酸不能完全分離；逐步提高pH值，4種有機(jī)酸逐漸得到分離，但草酸和酒石酸、蘋果酸的分離度卻逐漸減小；當(dāng)pH＞3.0時(shí)，檸草酸和酒石酸不能有效分離；當(dāng)pH 3.2時(shí)，部分有機(jī)酸的出峰順序發(fā)生變化。由于pH＜2.5的溶液會(huì)影響色譜柱的壽命，經(jīng)綜合考慮，最后選擇pH 2.6磷酸鹽緩沖溶液。

2.1.5 流動(dòng)相中甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 在流動(dòng)相中加入少量甲醇，能有效地改善峰形。以0.01 mol·L－1的 K2HPO4（pH 2.6）溶液作流動(dòng)相，對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醇（0，10 ，20，30，40，50 g·kg－1）對(duì)色譜分離的影響進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：隨著流動(dòng)相中甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，有機(jī)酸的疏水端基與固定相的相互作用減弱，保留時(shí)間變短，30 g·kg－1的甲醇-緩沖溶液分離度和峰形較好。

2.1.6 其他條件選擇 以體積分?jǐn)?shù)為3%的甲醇-磷酸二氫鉀（pH 2.6）溶液作流動(dòng)相比較了流速、柱溫對(duì)保留時(shí)間的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：流速0.2 mL·min－1時(shí)，分離度降低，草酸和酒石酸不能有效分離,流速0.1 mL·min－1時(shí)，由于流速太小，當(dāng)進(jìn)樣量較大時(shí)，影響分離效果；而柱溫增高則會(huì)加快傳質(zhì)過程，縮小分離度。因此，選擇在0.15 mL·min－1流速下及室溫（30℃）進(jìn)行測定。

2.2 超高效液相色譜分析

用HSS T3 C18柱，體積分?jǐn)?shù)為3%的甲醇-磷酸二氫鉀（pH 2.6）緩沖溶液作為混合流動(dòng)相，分析物可以在6 min內(nèi)得到很好的分離。草酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸的保留時(shí)間分別為：1.507±0.089，2.310±0.078，3.900±0.46，5.243±0.065 min，標(biāo)品的色譜圖如圖1所示。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度及回收率

取500 μmol·L－1氯化鋁的培養(yǎng)液4份，其中1份作本底（樣品色譜圖見圖1），另3份各添加不同量的有機(jī)酸標(biāo)品溶液按1.4（3）中的處理樣品方法處理后測定各成分，平行測定5次·樣品－1，考察方法的回收率和精密度。根據(jù)3.3中所述的方法將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積（mV·s）積分值為縱坐標(biāo)，標(biāo)品溶液的濃度（μg）為橫坐標(biāo)，求得線性回歸方程，結(jié)果見表1。4種分析物的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于2%；回收率均為95%～105%，表明該分析方法有很好的精密度和準(zhǔn)確度。

2.4 樣品的測定

樣品預(yù)處理后，按照已優(yōu)化的色譜方法注入超高效液相色譜儀中，根據(jù)分析物的保留時(shí)間及光譜圖對(duì)樣品中的色譜峰進(jìn)行定性，水培毛竹根系分泌物中可以檢出的有機(jī)酸為草酸和蘋果酸，另外2種有機(jī)酸未檢出。樣品色譜圖見圖2。結(jié)果表明：本方法測定不同濃度鋁處理的毛竹根系分泌物中的草酸和蘋果酸含量，結(jié)果如表2所示。

表1 有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Calibration curve of organic acids

圖1 4種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Figure 1 Liquid chromatogram of standard of 4 organic acids

圖2 500 μmol·L－1氯化鋁處理毛竹培養(yǎng)液中有機(jī)酸色譜圖Figure 2 Liquid chromatogram of organic acids in culture solution containing 500 μmol·L－1AlCl3

表2 不同濃度氯化鋁處理毛竹分根系泌出有機(jī)酸的量Table 2 Content of organic acids of culture solution containing different concentrations of AlCl3

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜法測定毛竹根系分泌物中的痕量有機(jī)酸，樣品制備簡便，分離效果好，方法的線性范圍及分析結(jié)果的精密度、準(zhǔn)確度和回收率都能滿足毛竹根系分泌物中痕量有機(jī)酸定性和定量分析的要求，并且具有樣品用量少，分析快速等特點(diǎn)，為植物根系分泌物中痕量有機(jī)酸的研究，以及植物根際環(huán)境中有機(jī)酸作用機(jī)理的探尋提供了重要的實(shí)驗(yàn)手段。結(jié)果表明：毛竹根系分泌的有機(jī)酸只有草酸和蘋果酸，并且草酸和蘋果酸的含量與鋁離子的濃度有一定的相關(guān)性，鋁離子的存在對(duì)毛竹根系有機(jī)酸的分泌有促進(jìn)作用。特別是當(dāng)氯化鋁濃度在 500 μmol·L－1時(shí)，促進(jìn)作用最明顯，在 1 000～ 2 000 μmol·L－1時(shí)，促進(jìn)作用相對(duì)減弱。

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