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    不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

    2011-05-30 03:30:40雷祖培余宏傲張書潤林瑞豐康華靖
    浙江農(nóng)林大學學報 2011年4期
    關(guān)鍵詞:繁殖系數(shù)塊莖浙江

    雷祖培,余宏傲,張書潤,林瑞豐,康華靖

    (1.浙江烏巖嶺國家級自然保護區(qū) 管理局,浙江 泰順 325500;2.溫州科技職業(yè)學院 園林系,浙江 溫州 325006)

    浙江雪膽Hemsleya zhejiangensis為葫蘆科Cucurbitaceae雪膽屬Hemsleya多年生攀援草本,僅分布于浙江溫州泰順烏巖嶺海拔800 m以下的山谷灌叢中和竹林下,為浙江特有種[1]。浙江雪膽塊莖具有清熱解毒、消腫止痛之功效,廣泛用于治療腸炎、菌痢、冠心病、氣管炎、慢性子宮頸炎、帶狀皰疹、腫瘤等多種疾病[2-4]。因其療效好,副作用低,因而在醫(yī)學上日益受到青睞,應(yīng)用前景十分廣闊。目前,對浙江雪膽的研究較少,哀建國等[5]對浙江雪膽群落學特征進行了調(diào)查研究;雷祖培等[6]對浙江雪膽體內(nèi)幾種金屬元素分布及其與土壤養(yǎng)分之間的關(guān)系進行了研究;葉曉霞等[4]探討了超聲提取——分光光度法測定浙江雪膽中總皂苷含量;葉曉霞等[7]從藥用角度測定浙江雪膽塊莖中的微量元素,證明浙江雪膽中含有豐富的人體必需微量元素,且微量元素的含量明顯高于中華雪膽,這為浙江雪膽的進一步的開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。由于浙江雪膽種群稀少,使用莖蔓扦插繁殖母本數(shù)量極少,扦插繁殖速度慢,同時容易受季節(jié)限制,嚴重阻礙了以這一新藥源植物的生產(chǎn)利用。本研究主要通過研究浙江雪膽的初代培養(yǎng)基和最佳植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比對其增殖的影響,以進一步為塊莖的快速誘導和增殖打下良好的基礎(chǔ),最終實施人工栽培,以解決其資源匱乏和物種的有效保護。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    浙江雪膽塊莖于2008年12月采自浙江烏巖嶺國家級自然保護區(qū)內(nèi)竹林下的雪膽群落,栽植于裝有腐殖質(zhì)土的花盆中,待長出幼苗后,采集具芽的幼嫩莖段作為外植體。試驗于2009年2月至2010年5月在溫州科技職業(yè)學院農(nóng)生系生物工程研究所植物組織培養(yǎng)實驗室中完成。

    1.2 試驗方法

    剪取莖段,用洗滌劑涮洗后自來水沖洗1 h,再用蒸餾水沖洗3次,然后在超凈工作臺中進行操作。用體積分數(shù)為70%乙醇浸泡30 s,100.0 g·kg-1次氯酸鈉浸泡8 min進行殺菌。消毒后的幼嫩莖段用無菌水浸洗5次,剪去基部,留1 cm左右的莖段,插栽在固體MS(Murashige and Skoog)基本培養(yǎng)基(蔗糖30.0 g·kg-1,瓊脂6.0 g·kg-1,pH 5.8)中,插入深度2~3mm。 在 (25±2)℃組培室中培養(yǎng)。7 d后除去污染瓶,繼續(xù)培養(yǎng),21 d時轉(zhuǎn)接,然后進行以下植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)影響的研究。

    1.2.1 6-芐基氨基腺嘌呤(6-BA)對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基,附加α萘乙酸(NAA)0.02 mg·L-1,酸堿度整為pH 5.8~6.0;蔗糖為30.0 g·L-1,瓊脂作凝固劑。設(shè)置質(zhì)量濃度分別為0, 0.10, 0.20, 0.50, 1.00, 2.00, 5.00 和 10.00 mg·L-1。

    1.2.2 NAA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基,附加6-BA 1.00 mg·L-1,設(shè)置質(zhì)量濃度分別為 0, 0.01, 0.05, 0.10, 0.50和 1.00 mg·L-1。

    1.2.3 不同質(zhì)量濃度NAA和6-BA配比對繁殖系數(shù)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基,附加6-BA和NAA,均設(shè)置5個質(zhì)量濃度(2.00,1.00,0.50,0.10和0 mg·L-1)組合進行不同配比試驗。1.2.4 不同基本培養(yǎng)基對繁殖系數(shù)的影響 分別以MS,B5,N6和WPM(woody plant medium)等4種培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1進行培養(yǎng)試驗。

    在光照強度為2000 lx左右,光照時間為10 h·d-1的培養(yǎng)室中進行恒溫(25±2)℃培養(yǎng)35后,記錄不同處理下浙江雪膽生長情況和繁殖系數(shù)。繁殖系數(shù)是指在一次繼代培養(yǎng)中,由一個繁殖單位(嫩莖、芽、或芽叢等)產(chǎn)生的新苗 (芽)個數(shù)。以上實驗均設(shè)5個重復,求其平均數(shù)。

    表1 6-BA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table1 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of 6-BA

    2 結(jié)果與討論

    2.1 6-BA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

    不同6-BA質(zhì)量濃度對浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)影響較大,不同質(zhì)量濃度之間差異都達到顯著水平 (表1)。 在質(zhì)量濃度 0.1~10.00 mg·L-1范圍內(nèi),浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)隨6-BA質(zhì)量濃度的升高而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,在0.50 mg·L-1時其繁殖系數(shù)最大,達到10.80;其次為1.00 mg·L-1,其值達到 6.80;再次為 0.20 mg·L-1和 2.00 mg·L-1; 其余質(zhì)量濃度下浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)較低。

    2.2 NAA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

    浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)在NAA質(zhì)量濃度為0 mg·L-1時,組培苗的繁殖系數(shù)為1.0;在低質(zhì)量濃度(小于0.20 mg·L-1)下,其繁殖系數(shù)隨著NAA質(zhì)量濃度的升高而增大,在0.20 mg·L-1時其值最大,達到5.6(表2);當NAA質(zhì)量濃度增加至0.50 mg·L-1時,浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)開始受到抑制。

    2.3 不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA配比對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

    不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA配比對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響結(jié)果見表3。試驗表明:最適宜于浙江雪膽組培快繁的芽分化誘導培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1和MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。2種配方下的浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)無顯著差異。

    表2 NAA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table2 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of NAA

    表3 6-BA和NAA不同質(zhì)量濃度配比對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table3 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of 6-BA and NAA

    2.4 不同基本培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

    以WPM,B5,N6和MS為基本培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響見表4。不同培養(yǎng)基下浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)均較高,其中以MS培養(yǎng)基的效果最佳,其繁殖系數(shù)達到16.80,與其他3種培養(yǎng)基相比,其差異達到了顯著水平。

    表4 不同培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table4 Effect of basic medium on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis

    3 討論和結(jié)論

    試驗表明:在沒有植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)處理下,浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)均為1.00;不同6-BA和NAA質(zhì)量濃度對其組培苗繁殖系數(shù)有較大影響,最佳質(zhì)量濃度分別為0.50 mg·L-1和0.20 mg·L-1,其繁殖系數(shù)分別為10.80和5.60;6-BA對浙江雪膽叢生芽分化的促進作用顯著高于NAA。不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA配比的最佳配方為MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1和 MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1, 2 種配比下組培苗繁殖系數(shù)分別為19.30和18.10,與單一植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)最佳質(zhì)量濃度下相比,其差異也均達到了顯著水平。

    通過試驗觀察,25~35 d為1個繼代周期是較為適宜的,因為這個時期誘導的效果可以充分表現(xiàn)出來,而培養(yǎng)基的成分還沒有完全變化到影響組織的生長,并且可為轉(zhuǎn)接提供較大量的材料。浙江雪膽對組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分的要求并不嚴格,基本培養(yǎng)基MS,B5,N6和WPM均可作為組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基,都可滿足浙江雪膽生長的需要,就快速繁殖而言,MS和B5培養(yǎng)基是比較適宜的培養(yǎng)基。

    植物組織培養(yǎng)再生小植株一般有3條途徑:一是外植體先形成愈合組織,愈合組織分化出不定芽,由不定芽再發(fā)育成小植株;二是由外植體表面直接誘導產(chǎn)生小鱗莖或小芽,再由小鱗莖或不定芽發(fā)育成小植株;三是由組織表層和內(nèi)層一些特化了的胚性細胞經(jīng)多次分裂發(fā)育成胚狀體而形成小鱗莖,小鱗莖再形成小植株。本實驗采用第1種途徑,該方法較易進行,但繁殖周期較長。本實驗發(fā)現(xiàn)除了以上3種增殖方式外,浙江雪膽的組培苗在初代培養(yǎng)(2009年2月)中不經(jīng)生根階段就可形成微型塊莖(2009年9月)(圖1),且該微型塊莖可直接發(fā)育成新個體。此法如能和莖尖培養(yǎng)結(jié)合起來,將為浙江雪膽脫毒種塊莖的繁育建立很好的體系。但是第2年(2010年)繼代培養(yǎng)則未發(fā)現(xiàn)微型塊莖的形成,推測與取樣時間和部位相關(guān),具體原因尚需進一步研究。

    圖1 分別為浙江雪膽的花、塊根、初代培養(yǎng)幼苗和愈合組織Figure1 Hemsleya zhejiangensis: flower, tuber, initial culture seedling and callus

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