血清藥理學方法評價叔丁基對苯二酚的安全性

郝鵬鵬，倪晉仁，孫衛(wèi)玲

（1.首都經濟貿易大學安全與環(huán)境工程學院，北京 100070；2.北京大學環(huán)境科學與工程學院，北京 100871）

血清藥理學方法評價叔丁基對苯二酚的安全性

郝鵬鵬1，倪晉仁2，孫衛(wèi)玲2

（1.首都經濟貿易大學安全與環(huán)境工程學院，北京 100070；2.北京大學環(huán)境科學與工程學院，北京 100871）

運用血清藥理學方法評價食品抗氧化劑叔丁基對苯二酚的毒性。大鼠灌胃700 mg/kg叔丁基對苯二酚后，分別于0.08、0.25、0.50、24.00、48.00 h采血，分離血清。以人正常肝細胞HL7702為研究對象，采用MTT法檢測叔丁基對苯二酚、含叔丁基對苯二酚及其代謝物血清的細胞毒性，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài)變化。結果表明：雖然高濃度的叔丁基對苯二酚會抑制細胞生長，并使細胞形態(tài)學特征改變，但叔丁基對苯二酚經體內代謝后的血清對細胞生長無顯著性抑制作用。因此，在衛(wèi)生標準許可范圍內，叔丁基對苯二酚食用安全。

叔丁基對苯二酚；安全性評價；血清藥理學；人正常肝細胞HL7702

合成酚類抗氧化劑叔丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）具有高效的抗氧化性能，并且耐高溫、抗菌[1]。我國于1991年批準在油脂制品、堅果與籽類罐頭、方便米面制品、餅干、腌臘肉制品、水產品和油炸食品中使用，最大添加量為200 mg/kg[2]。然而，TBHQ的安全性一直存在爭議，并引起社會廣泛關注[3]。體內試驗表明：TBHQ急性毒性低，具有輕微的皮膚刺激性和眼刺激性[4-5]；TBHQ的體內代謝物[6-7]有叔丁基對苯醌、TBHQ-硫酸結合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結合物、TBHQ-谷胱甘肽結合物和極性不明代謝物等。體外試驗表明：TBHQ[8-14]、叔丁基對苯醌[12]、TBHQ-谷胱甘肽結合物[15]具有細胞毒性。但上述研究仍存局限性：體內試驗是整體動物試驗，不能深入解釋TBHQ的毒性作用機制；體外試驗雖然能夠研究TBHQ或某種代謝物對細胞的毒性機理，但是TBHQ經體內代謝后真正對細胞產生毒性的可能是其他代謝物。近些年，在中藥藥理學研究領域新興的血清藥理學試驗方法能很好地將體內和體外試驗相結合[16]，本文運用該方法研究TBHQ經體內代謝后的毒性，為其安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

成年Sprague-Dawley大鼠[雄性，體重（160±10）g]：北京大學醫(yī)學部實驗動物部，合格證號SCXK（京）2002-0003；人正常肝細胞HL7702細胞株：中科院細胞所。

1.1.2 試劑

食品級TBHQ（>96.0%）：廣州泰邦食品添加劑有限公司；四甲基偶氮噻唑藍（MTT）、十二烷基磺酸鈉（SDS）：美國Sigma公司；乙酸乙酯（色譜純）：天津福晨化學試劑廠；甲醇（色譜純）：美國Fisher Scientific公司；RPMI1640培養(yǎng)基、新生胎牛血清、胰酶：北京欣經科生物技術有限公司。

1.1.3 儀器

高效液相色譜/離子阱質譜聯用儀HP 1100 LC/MSD Trap SL System（配有二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器和電噴霧電離源）：美國Agilent公司；CO2細胞培養(yǎng)箱：美國Revco公司；酶標儀Multiskan MK3：美國Thermo公司；倒置相差顯微鏡DIAPHOT-MD：日本Nikon公司；高速離心機TGL-16C型：上海安亭科學儀器廠；微型混合器WH-90A型：上海亞榮生化儀器廠；超純水機MILLI-Q GRADIENT SYSTEM：美國MILLIPORE公司；電子分析天平BP210S和BP211D：德國Sartorius公司；一次性尼龍針式過濾頭（0.22μm）：北京北化黎明膜分離技術有限責任公司；96孔培養(yǎng)板：美國Corning公司。

1.2 血清制備

TBHQ的口服半致死量（LD50）為700 mg/kg～1000 mg/kg[6]，本文將劑量設為700 mg/kg。按體重準確稱量TBHQ后，制成1 mL玉米油懸浮液灌胃。設立空白組，以1 mL玉米油灌胃。

大鼠（n＝6） 灌胃后分別于0.08、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00、12.00、24.00和48.00 h尾靜脈采血0.2 mL，置于冰盒中，4℃冰箱保存。

血樣在12000 r/min下離心20 min，將上清液轉移至1.5 mL離心管內，即得血清。

1.3 血清分析

1.3.1 樣品前處理

移取血清100 μL至1.5 mL離心管內，加入100 μL超純水，振蕩1 min，加入1 mL乙酸乙酯，振蕩3 min，在12000 r/min下離心20 min，移取萃取液800 μL至1.5 mL離心管內，氮氣緩慢吹干（25℃），100 μL甲醇定容，轉移至進樣瓶內，用于TBHQ的分析，在移取萃取液后的殘余液中加入200 μL甲醇，振蕩3 min，在12000 r/min下離心20 min，移取100 μL上清液至進樣瓶內，用于TBHQ-硫酸結合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的分析。

1.3.2 儀器分析

液相色譜/質譜聯用條件：詳見參考文獻[7]。

1.4 細胞抑制率檢測

1.4.1 溶液配制

MTT溶液（5 g/L）：0.0500 g MTT溶于10 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS），0.22μm微孔濾膜過濾，4℃冰箱保存。

酸性SDS溶液（100 g/L）：10.0000 g SDS溶于100 mL 0.1%的鹽酸。

1.4.2 細胞培養(yǎng)

TBHQ經體內代謝后主要分布在腎臟和肝臟中[6]，因此本文選用人正常肝細胞HL7702為研究對象，采用含10%熱滅活新生胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代1次。

1.4.3 MTT法

取對數期細胞做試驗，緩慢倒出培養(yǎng)基，并將殘留培養(yǎng)基輕輕吸出，加入胰酶1 mL，潤洗瓶壁后吸出，加入胰酶2 mL，當在顯微鏡下觀察到細胞大片脫落并將要分離而呈現圓粒狀時，加入培養(yǎng)基2 mL，制成單細胞懸液，調整細胞密度為2×104cells/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，輕輕吸除培養(yǎng)基，加入含待測物的培養(yǎng)基100 μL，并設立對照組，每一濃度設3個平行孔，培養(yǎng)24 h后，輕輕吸除培養(yǎng)基，每孔加入培養(yǎng)基100 μL和MTT溶液10 μL，培養(yǎng)5 h后，加入酸性SDS溶液100 μL，輕輕振蕩，放置12 h后，用酶標儀測定吸光度（A），檢測波長為540 nm。

1.4.4 數據處理

采用SPSS13.0軟件進行t檢驗或相關分析，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 采血時間點的選擇

運用液相色譜/質譜聯用法研究TBHQ及2種代謝物在大鼠血清中的濃度變化規(guī)律。TBHQ和代謝物TBHQ-硫酸結合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的質譜圖及裂解規(guī)律分別見文獻[17]和[7]。分別以萃取離子流圖（EIC）中TBHQ的二級質譜離子m/z 149、TBHQ-硫酸結合物的一級質譜離子m/z 245和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的一級質譜離子m/z 341的峰面積作為其血清濃度高低的判斷依據。大鼠灌胃700 mg/kg TBHQ后，對不同時間點的血清樣品進行分析，得到TBHQ及其代謝物的平均質譜峰面積-時間分布曲線（圖1）：TBHQ、TBHQ-硫酸結合物及TBHQ-葡萄糖醛酸結合物濃度達到峰值的時間分別為0.25、0.50、0.50 h。因此，本文采集大鼠灌胃后0.08、0.25、0.50、24.00、48.00 h 5個典型時間點的血清進行血清毒性實驗。

2.2 TBHQ經體內代謝前、后的毒性

為評價TBHQ的安全性，采用MTT法研究TBHQ經大鼠體內代謝前、后對人正常肝細胞HL7702的毒性。

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的TBHQ進行試驗，結果表明（圖2）：當濃度高于0.2 mmol/L時，TBHQ會抑制HL7702細胞的生長（P<0.05）；隨著濃度的升高，TBHQ的抑制作用增強，當濃度高于0.4 mmol/L時，抑制率達到70%以上，大部分HL7702細胞死亡。

以含10%熱滅活新鮮小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基為對照，當培養(yǎng)基中分別添加10%、20%、100%的大鼠空白血清時，細胞抑制率分別為（-15.6±11.4）%（P>0.05）、（-19.9±8.2）%（P>0.05）、（-25.4±6.4）%（P<0.05），因此培養(yǎng)基中高比例添加大鼠血清會促進HL7702細胞的生長。為避免大鼠血清對分析的干擾，血清毒性實驗以培養(yǎng)基中添加相同比例的大鼠空白血清為對照，結果（表1）表明：A值均無顯著性變化（P>0.05），抑制率低于15%。因此，TBHQ經大鼠體內代謝后的血清對HL7702細胞的生長無顯著性抑制作用。

表 1 含TBHQ及其代謝物的血清對人正常肝細胞HL7702的抑制率Table 1 The inhibition ratio of human normal hepatic cellsHL7702 by the serums containing TBHQ and its metabolites

在倒置顯微鏡下觀察人正常肝細胞HL7702的生長狀態(tài)，結果（圖3）表明：高濃度的TBHQ會使細胞體積縮小，細胞形態(tài)由不規(guī)則形變?yōu)閳A形；而TBHQ經大鼠體內代謝后的血清則未使細胞形態(tài)發(fā)生變化。

3 結論

運用血清藥理學試驗方法對TBHQ的毒性進行評價，結果表明：雖然高濃度的TBHQ本身具有一定的毒性，抑制人正常肝細胞HL7702生長，并改變細胞生長形態(tài)，但經大鼠體內代謝后的含TBHQ及其代謝物的血清對細胞生長無顯著性抑制作用。

FAO/WHO于1999年規(guī)定TBHQ的每人每天允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為0mg/kg～0.7mg/kg[12]，遠低于本文采用的劑量700 mg/kg。因此，在衛(wèi)生標準許可范圍內，TBHQ食用安全，但仍需更為深入的人體代謝研究來證明。

[1]梁瑩,崔炳群.TBHQ在富油食品中的應用現狀和前景[J].食品工業(yè)科技,2007(12):228-230

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標準化管理委員會.GB2760-2007食品添加劑使用衛(wèi)生標準[S].北京:中國標準出版社,2008

[3]黃小希.麥當勞麥樂雞抽檢結果公布[N].中國質量報,2010,7(23):5

[4]Patrick E,Juberg DR,O’Donoghue J,et al.Depigmentation with tert-Butyl Hydroquinone Using Black Guinea Pigs[J].Food and chemical toxicology,1999,37(2/3):169-175

[5]徐蕾蕊,周志俊.特丁基對苯二酚毒理學特點[J].環(huán)境與健康雜志,2010,27(12):1114

[6]Ikeda GJ,Sapienza PP,Ross IA.Distribution and excretion of radiolabelled tert-butylhydroquinone in Fischer 344 rats[J].Food and Chemical Toxicology,1998,36(11):907-914

[7]郝鵬鵬,孫衛(wèi)玲,黃文,等.叔丁基對苯二酚在大鼠體內的代謝研究[J].毒理學雜志,2007,21(1):30-33

[8]NAGAI F,OKUBO T,USHIYAMA K,et al.Formation of 8-hydroxydeoxyguanosine in calf thymus DNA treated with tertbutylhydroquinone,a major metabolite of butylated hydroxyanisole[J].Toxicology Letters,1996,89(2):163-167

[9]Nakagawa Y.Effects of dicoumarol on cytotoxicity caused by tertbutylhydroquinone in isolated rat hepatocytes[J].Toxicology Letters,1996,84(2):63-68

[10]Okubo T,Nagai F,Uuhiyama K,et al.Contribution of oxygen radicals to DNA cleavage by quinine compounds derived from phenolic antioxidants,tert-butylhydroquinone and 2,5-di-tertbutylhydroquinone[J].Toxicology Letters,1997,90(1):11-18

[11]Li Y,Seac at A,Kuppusamy P,et al.Copper redox-dependent activation of 2-tert-butyl(1,4)hydroquinone:formation of reactive oxygen species and induction of oxidative DNA damage in isolated DNA and cultured rat hepatocytes[J].Mutation Research,2002,518(2):123-133

[12]Okubo T,Yokoyama Y,Kano K,et al.Cell death induced by the phenolic antioxidant tert-butylhydroquinone and its metabolite tertbutylquinone in human monocytic leukemia U937 cells[J].Food and Chemical Toxicology,2003,41(5):679-688

[13]Kashanian S,Ezzati NAZHAD DOLATABADI J.DNA binding studies of 2-tert-butylhydroquinone(TBHQ)food additive[J].Food Chemistry,2009,116(3):743-747

[14]Shahabadi,MAGHSUDI M,KIANI Z,et al.Multispectroscopic studies on the interaction of 2－tert－butylhydroquinone（TBHQ），a food additive,with bovine serum albumin[J].Food Chemistry,2011,124(3):1063-1068

[15]Haenen HEMG,Bleijlevens E,Elzerman H,et al.Cytotoxicity of 2-tert-butyl hydroquinone glutathione conjugates after apical and basolateral exposure of rat renal proximal tubular cell monolayers[J].Toxicology in Vitro,1996,10:141-148

[16]李靜,殷飛,姚樹坤.血清藥理學研究進展[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2009,15(3):234-236

[17]Hao Pengpeng,Ni Jinren,Sun Weiling,et al.Determination of tertiary butylhydroquinone in edible vegetable oils by liquid chromatography/ion trap mass spectrometry[J].Food Chemistry,2007,105(4):1732-1737

Safety Evaluation of Tertiary Butylhydroquinone by Serum Pharmacology

HAO Peng－peng1，NI Jin－ren2，SUN Wei－ling2
（1.School of Safety and Environmental Engineering，Capital University of Economics and Business，Beijing 100070，China；2.College of Environmental Sciences and Engineering，Peking University，Beijing 100871，China）

To evaluate the toxicity of tertiary butylhydroquinone，a food antioxidant，the experiment was accomplished by serum pharmacology.After a single gavage dose of 700 mg/kg，the blood samples were taken at 0.08，0.25，0.50，24.00 and 48.00 h，and the serums were separated.Using MTT method，effects of tertiary butylhydroquinone and the serums containing tertiary butylhydroquinone and its metabolites on inhibiting proliferation of human normal hepatic cells HL7702 were respectively studied，and changes of cell morpha were observed with inverted microscope.The results showed that the serums containing tertiary butylhydroquinone and its metabolites had no significant inhibitory effect on the in vitro growth of HL7702 cells，although tertiary butylhydroquinone in the high concentration range significantly had inhibitory effect and changed the cell morpha.Therefore，tertiary butylhydroquinone is safe by oral exposure under the current standards.

tertiary butylhydroquinone；safety evaluation；serum pharmacology；human normal hepatic cells HL7702

郝鵬鵬（1979—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品安全。

2011-04-10