反相液相色譜法測定發(fā)酵蟲草菌粉腺苷含量

張安寧，袁書林，，*，孫林超，張建華，郭小華

（1.江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.淮安淮大科技發(fā)展有限公司，江蘇 淮安 223003）

反相液相色譜法測定發(fā)酵蟲草菌粉腺苷含量

張安寧1，袁書林1，2，*，孫林超1，張建華1，郭小華2

（1.江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.淮安淮大科技發(fā)展有限公司，江蘇 淮安 223003）

通過樣品處理及檢測條件的優(yōu)化，建立發(fā)酵蟲草菌粉腺苷含量的RP-HPLC檢測方法。結(jié)果表明：Agilent-C18柱（4.6 mm×300 mm，5μm），乙腈+甲醇+水=5+5+90（體積比）作為流動相，檢測波長260 nm，流速為1.2 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，腺苷濃度在10μg/mL～50μg/mL時，濃度與峰面積呈線性關(guān)系，最低檢出濃度為1.2μg/mL，定量限為4.0μg/mL，加標(biāo)回收率為95.30%～105.20%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.32%～5.70%。

蟲草菌粉；腺苷；檢測；RP-HPLC

冬蟲夏草是我國特有珍稀名貴中藥材，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、升白細(xì)胞、降血壓、抗衰老、抗疲勞、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善心肌缺血、抑菌、抗病毒、鎮(zhèn)靜、止血、抗驚厥、抗血小板凝結(jié)等多種作用[1-4]。由于天然冬蟲夏草嚴(yán)格的寄生性與特殊的生態(tài)環(huán)境要求，產(chǎn)量十分有限，加上近年來盲目過度采挖，其野生資源逐年萎縮，開發(fā)野生冬蟲夏草代用品勢在必行，目前通常的做法是通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)蟲草菌絲體以生產(chǎn)發(fā)酵蟲草菌粉。發(fā)酵蟲草菌粉在活性成分、藥理作用等方面與天然冬蟲夏草基本一致，可以做為冬蟲夏草的替代品。目前被學(xué)術(shù)界和國家食品藥品監(jiān)管部門認(rèn)可的發(fā)酵蟲草菌粉生產(chǎn)菌種主要有蝙蝠蛾被毛孢（即中國被毛孢）以及蝙蝠蛾擬青霉、蟲草被孢霉、蛹蟲草等，雖然其功效成分和藥理作用不盡相同，但腺苷是共同的主要有效成分之一，被用作發(fā)酵蟲草菌粉的質(zhì)量控制指標(biāo)。

目前腺苷含量的檢測方法主要有分光光度法、薄層色譜法（TLC），高效液相色譜法（HPLC）和毛細(xì)管電泳法（CE）等，其中以HPLC最適用[5-11]。本試驗采用RPHPLC法對發(fā)酵蟲草菌粉中的腺苷含量進(jìn)行分析，優(yōu)化了樣品處理及檢測條件，旨在建立發(fā)酵蟲草菌粉腺苷含量的快速、準(zhǔn)確檢測方法，為發(fā)酵蟲草菌粉類藥品和生物制品的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀、紫外檢測器、化學(xué)工作站；Agilent－C18（4.6 mm×300 mm，5μm）；TU－1900雙光束紫外可見分光光度計、GWA-UN2-F20超純水器：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BT25S（0.01 mg）電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SK-12E超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；0.45μm微孔濾膜。

甲醇（HPLC級）：江蘇漢邦科技有限公司；乙腈（純度99.9%）：天津市北辰方正試劑廠；腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：美國sigma公司；腺苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg/mL），腺苷標(biāo)準(zhǔn)使用液（10μg/mL）。

1.2 試驗樣品

發(fā)酵蟲草菌粉：江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院江蘇省食品微生物工程實驗室保藏菌種，由淮安淮大科技科技發(fā)展有限公司采用液體深層發(fā)酵方法100 L罐中試生產(chǎn)。野生冬蟲夏草：于2009年5月采集于青海玉樹，自然風(fēng)干。

1.3 試驗條件

Agilent-C18柱（4.6 mm×300 mm，5μm），流動相：乙腈+甲醇+水=5+5+90（體積比），檢測波長260 nm，流速為1.2 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.4 樣品的制備

將樣品于45℃烘干至恒重，根據(jù)樣品中腺苷的含量稱取適量置于100 mL碘量瓶中,加入20 mL 50%乙醇溶液,超聲破碎30 min，轉(zhuǎn)移到離心管中離心后取上清液移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行減壓濃縮，再用流動相定容至25 mL，然后經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，濾液供分析。同時制備1份空白溶液。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取腺苷標(biāo)準(zhǔn)使用液用流動相配制成濃度為0、10、20、30、40、50μg/mL的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.3所述儀器條件進(jìn)樣20 μL，測峰面積A繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在同樣條件下，注入樣品溶液20 μL，測峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腺苷含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 腺苷光譜圖和色譜圖

腺苷紫外吸收光譜圖、標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖、樣品色譜圖、樣品加標(biāo)提取色譜圖如圖1、圖2、圖3、圖4所示。

2.2 檢測波長的選擇

通過掃描腺苷溶液的紫外吸收光譜可以看出，腺苷溶液在220 nm和260 nm處均有紫外吸收。在260 nm處紫外吸收達(dá)到最大，因此選擇260 nm作為檢測波長，具有較高靈敏度，腺苷與其它干擾峰能夠完全分離，沒有拖尾現(xiàn)象。

2.3 腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，腺苷濃度在10×10-6g/mL～50×10-6g/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為 A=93.659C+30.829，R=0.9994。

2.4 提取劑、提取劑濃度及用量的選擇

樣品中的腺苷可用不同溶劑來提取，本試驗采用不同濃度的甲醇或乙醇進(jìn)行提取。試驗表明乙醇有溶劑干擾，故選用甲醇作為提取劑。

經(jīng)用25%、50%、75%、100%甲醇濃度進(jìn)行試驗，結(jié)果見圖6。

由圖6可知：50%甲醇提取率最大。分別用10、20、30、40、50 mL提取劑進(jìn)行試驗，結(jié)果見圖7。

由圖7可知：20 mL提取劑時腺苷的提取量達(dá)到最大，故提取劑的用量選定為20 mL。

2.5 超聲波提取時間的選擇

稱取樣品適量，置于具塞三角瓶中，加入20mL50%的乙醇溶液，再分別選擇 0、10、20、30、40、50 min等不同的超聲波處理時間提取，而后轉(zhuǎn)移到離心管中，5000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行濃縮、定容，用0.45μm微孔濾膜過濾，待HPLC檢測并對比腺苷溶出量，見圖8。

由圖8可以看出，不經(jīng)過超聲波處理的幾乎測不出腺苷，隨著處理時間的增加，腺苷溶出量明顯增加，超聲波處理30 min腺苷的溶出量達(dá)到最大，溶出量達(dá)到5.39 mg/g。

2.6 流動相及配比的選擇

在其它色譜條件不變情況下，分別用乙腈＋水、甲醇＋水、甲醇＋0.01 mol/L磷酸二氫鉀、甲醇＋0.06 mol/L磷酸二氫鉀＋四氫呋喃、乙腈＋甲醇＋水作為流動相進(jìn)行試驗，試驗表明，乙腈+甲醇+水作為流動相，分離效果最好。通過對流動相乙腈＋甲醇＋水進(jìn)行配比試驗，試驗表明乙腈＋甲醇＋水＝5+5+90，峰形良好，保留時間適中，與其它干擾峰能夠完全分離，沒有拖尾現(xiàn)象。

2.7 方法考察

精密稱取高、中、低3種腺苷含量的樣品進(jìn)行處理得到待測溶液，各重復(fù)測定6次，結(jié)果見表1。

表 1 精密度試驗結(jié)果Table 1 Results of precision test

由表1可以看出，方法有良好的重現(xiàn)性，重復(fù)6次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為2.32%、3.54%、5.70%。

在待測樣品中加入一定量的腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，按照樣品處理方法，制得加標(biāo)待測樣品溶液，各重復(fù)測定6次，結(jié)果見表2。

表 2 回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of recovery test

由表2可見回收率在95.3%～105.2%之間。

按選定的條件對空白溶液進(jìn)行12次測定，根據(jù)公式LOD=3Sb/S、LOQ=10Sb/S（Sb為空白溶液的峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為回歸直線的斜率）求得方法的檢出限為1.2μg/mL；定量限為4μg/mL，說明本分析方法可滿足發(fā)酵蟲草菌粉中腺苷含量檢測要求。

2.8 不同發(fā)酵蟲草菌粉按本方法測得的腺苷含量

采用本試驗建立的方法，檢測了不同發(fā)酵蟲草菌粉的腺苷含量，結(jié)果如表3所示。

表 3 樣品中腺苷的含量Table 3 Results of the adenosine concentrations in samples

從表3可以看出，不同發(fā)酵蟲草菌粉的腺苷含量不同，其中以中國被毛孢菌粉含量最高，而蛹蟲草菌粉最低，但都要高于野生冬蟲夏草。

3 結(jié)論

本試驗通過樣品的超聲波前處理、提取溶劑濃度、檢測波長、流動相及配比、精密度、回收率等進(jìn)行優(yōu)化、討論，建立了發(fā)酵蟲草菌粉腺苷含量的RP-HPLC檢測方法。結(jié)果表明：Agilent－C18柱（4.6 mm×300 mm，5μm），乙腈+甲醇+水=5+5+90（體積比）作為流動相，檢測波長260 nm，流速為1.2 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量為20 μL，腺苷濃度在10μg/mL～50μg/mL時，濃度與峰面積呈線性關(guān)系，最低檢出濃度為1.2μg/mL，定量限為4.0μg/mL，加標(biāo)回收率為95.30%～105.20%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.32%～5.70%，測定組分峰形良好，與其它峰能夠完全分離，沒有拖尾現(xiàn)象，穩(wěn)定性好、回收率高、簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確。

本方法在樣品前處理、腺苷的提取、流動相的優(yōu)化、有害試劑的使用量、環(huán)境的污染、操作過程中腺苷的損失、方法的精密度、準(zhǔn)確度等方面均優(yōu)于參考文獻(xiàn)，經(jīng)大量樣品分析表明，此方法所受干擾較少，具有快速、簡便、經(jīng)濟的特點。

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Determination of Adenosine in the Mycelia of Cordyceps Epiphytes by RP-HPLC Method

ZHANG An－ning1，YUAN Shu－lin1，2，*，SUN Lin－chao1，ZHANG Jian－h(huán)ua1，GUO Xiao－h(huán)ua2
（1.Jiangsu Food Science College，Huaian 223003，Jiangsu，China；2.Huaian HITEK Science and Technology Development Co.，Ltd.，Huaian 223003，Jiangsu，China）

The methold for the determination of adenosine concentrations in the mycelia of cordyceps epiphytes by RP－HPLC was established through the optimization of sample process and detection conditions.The results showed that the chromatographic conditions included Agilent－C18column（4.6 mm × 300 mm，5μm）and the mobile phase consisting of acetonitrile，methanol and water by 5∶5∶90（volume ratio）.The detection wavelength was at 260 nm.The flow rate was 1.2 mL/min.The column temperature was at 35 ℃.The sample dose was 20 μL.When the concentration of adenosine was at 10μg/mL to 50μg/mL，the perfect linearity between concentration and peak area ratio was obtained.The detection limit was 1.2μg/mL and the quantificational limit was 4.0μg/mL.The recovery rate was 95.30%to 105.20%.The relative standard deviation（RSD）was 2.32%to 5.70%.

Mycelia of cordyceps epiphytes；adenosine；determination；RP－HPLC

淮安市科技支撐計劃（工業(yè)）項目（HAG08061）；淮安市科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新引導(dǎo)資金項目（HAC201003）

張安寧（1956—），男（漢），教授，高級工程師，學(xué)士,研究方向：食品生物技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用。

*通信作者：袁書林（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：營養(yǎng)保健與功能性食品。

2011-03-24