離子注入水稻細(xì)胞學(xué)效應(yīng)研究

代西梅, 張佳佳， 楊 旭， 黃群策

(鄭州大學(xué) 河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 鄭州 450052)

離子注入水稻細(xì)胞學(xué)效應(yīng)研究

代西梅, 張佳佳， 楊 旭， 黃群策

(鄭州大學(xué) 河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 鄭州 450052)

以水稻品種紫粳二倍體和四倍體為實(shí)驗(yàn)材料，以低能氮離子束為誘變源，研究了離子束誘變對水稻根尖細(xì)胞染色體的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低能離子束注入引起了水稻根尖分生區(qū)細(xì)胞有絲分裂異常，出現(xiàn)許多染色體畸變類型，包括后期染色體橋、落后染色體、染色體斷片、中期染色體單價體等.染色體畸變率并不是隨著劑量的增加呈現(xiàn)直線上升的趨勢，而是有一定的擺動性，但總體趨勢是注入劑量越大，畸變率越高.由此可見，離子注入引起水稻染色體異常是其發(fā)生遺傳性變異的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ).

水稻； 離子束注入； 有絲分裂； 誘變； 染色體

0 引言

20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的離子束生物技術(shù)[1]，具有獨(dú)特的技術(shù)原理和簡單的操作程序，在作物育種中其實(shí)用性已經(jīng)被越來越多的研究結(jié)果所證實(shí)[2-3].它具有質(zhì)量、能量、電荷三位一體的功效，損傷輕，誘變率高，誘變譜寬[4],在誘變育種中取得了不少成果[5-6].但其基礎(chǔ)理論研究仍很薄弱，尤其是從染色體以及蛋白質(zhì)分子水平開展的研究甚少[7-8].同時低能重離子與生物物質(zhì)的相互作用不但涉及能量沉積，而且還包含質(zhì)量沉積及動量傳遞、電荷交換等物理過程，因而其作用機(jī)理比γ射線復(fù)雜得多，致使生物體誘變的作用機(jī)制仍未有統(tǒng)一的、合理的、明確的解釋.

水稻是世界上重要的糧食作物之一，對其遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)的研究已有上百年的歷史.作者通過對離子束注入處理的水稻與其對照進(jìn)行細(xì)胞學(xué)及染色體形態(tài)的研究，探討了離子注入對水稻誘變的特點(diǎn)，并利用離子注入技術(shù)提高水稻的突變率，篩選變異材料，用于水稻遺傳育種研究.

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

水稻品種紫粳二倍體及四倍體材料，由鄭州大學(xué)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2離子注入方法

挑選籽粒飽滿的水稻成熟種子脫殼，種子胚朝上置于同一個鋪有花泥的培養(yǎng)皿中，將其置入從俄羅斯進(jìn)口的Titan脈沖式離子注入機(jī)的靶室中進(jìn)行氮離子注入.注入劑量分別為4×1017，6×1017，8×1017N+/cm2.每劑量每次處理成熟干種子500粒，重復(fù)3次.在靶室中氮離子源的注入能量25 keV，注入時的真空度5×10-2Pa，采用脈沖式注入，束流200 mA.未注入的同一批紫粳材料作為對照.

1.3根尖分生區(qū)細(xì)胞有絲分裂染色體行為觀察

材料準(zhǔn)備：將種子浸泡24 h后，放置在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃暗培養(yǎng)，生根.

固定：幼根長1～2 cm時，上午9：00～11：00用卡諾固定液(V(酒精)∶V(醋酸)=3∶1)固定2～24 h，70%酒精清洗后放入70%酒精中4 ℃保存?zhèn)溆?保存時間一般不超過1 w).

解離：將固定好的材料放入解離液(V(無水乙醇)∶V(37%的濃鹽酸)=1∶1)中，室溫下解離5～10 min.

染色：用蒸餾水清洗數(shù)次,徹底洗去解離液，根尖放在解剖鏡下找出分生區(qū)(一個解離良好的材料，分生區(qū)在解剖鏡下是不透明的，而成熟區(qū)和根冠部分則是透明的)，在解剖鏡下用刀片把分生區(qū)切為2～3部分，使細(xì)胞更易著色.然后在載玻片上滴上卡寶品紅染色液[9]進(jìn)行染色，染色時需要在酒精燈上微微加熱，染色時間10 min.

壓片：將蓋玻片的一側(cè)與染色液接觸，待染色液沿接觸面均勻擴(kuò)散后，再緩慢放下蓋玻片，用吸水紙吸取多余的染色液.用拇指以適當(dāng)?shù)牧Χ劝磯?用鉛筆輕輕敲擊蓋片，使染色體充分分散.

將壓好的片子置于顯微鏡下觀察，找到良好的細(xì)胞分裂相各期細(xì)胞，對發(fā)生染色體異常行為的有絲分裂細(xì)胞進(jìn)行分類統(tǒng)計并取相.每個處理至少觀察30個根尖，每個根尖取10個視野進(jìn)行觀察統(tǒng)計.

2 結(jié)果與分析

2.1低能氮離子處理后水稻根尖細(xì)胞的有絲分裂過程觀察

有絲分裂是一個連續(xù)、動態(tài)的過程，一般分為5個時期，如圖1.在這5個時期中最明顯的特征就是染色體呈現(xiàn)出連續(xù)、動態(tài)的變化.在光學(xué)顯微鏡下，根據(jù)染色體的收縮程度、集結(jié)情況等特征來確定細(xì)胞所處的分裂時期.

圖1 水稻根尖細(xì)胞有絲分裂過程的顯微觀察Fig.1 Observe the mitotic process of the rice

離子注入引起染色體結(jié)構(gòu)異常和細(xì)胞分裂中染色體的行為改變(圖2).結(jié)果表明，在離子注入后的根尖細(xì)胞中，出現(xiàn)了一些染色體或染色單體斷片(圖2b～d).在分裂后期不能正常向細(xì)胞的兩極移動，滯留在細(xì)胞成膜體附近，形成落后染色體(圖2a)；具有雙著絲粒的染色體，在分裂后期可能受到來自兩極的紡錘絲牽引，形成橋式結(jié)構(gòu)(圖2e～f)，并隨著分裂的進(jìn)行最終導(dǎo)致染色體斷裂，也有可能形成運(yùn)動滯后的染色體.運(yùn)動滯后的染色體或斷片在一定的時限內(nèi)不能到達(dá)細(xì)胞的極點(diǎn)，末期核膜重建時不能包被到子核當(dāng)中，成為細(xì)胞中的微核(圖2g).其中斷片形成細(xì)胞中體積較小的微核，滯后染色體形成細(xì)胞中另一類體積較大的微核.因?yàn)椴糠旨?xì)胞中同時存在多種染色體異常，如多個斷片與滯后染色體同時存在，分裂末期可能因相距較遠(yuǎn)不能包被到同一微核內(nèi)，使細(xì)胞中出現(xiàn)多個微核.

圖2 離子注入材料有絲分裂染色體異常行為Fig.2 Chromosome aberrances in mitosis of cells implemented by ion beam

2.2不同劑量的氮離子注入對水稻根尖細(xì)胞染色體畸變率的影響

對離子注入處理的水稻根尖細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)不同水稻材料在不同劑量處理下均出現(xiàn)了染色體橋、染色體小斷片和落后染色體等畸變類型，但其畸變率均小于1%，如表1所示.在二倍體和對應(yīng)的四倍體水稻的根尖細(xì)胞中染色體橋、染色體片段和落后染色體的畸變率并不是隨著劑量的增加呈現(xiàn)直線上升的趨勢，而是有一定的擺動性，但總體趨勢是注入劑量越大，畸變率越高.4×1017N+/cm2和6×1017N+/cm2劑量處理，水稻根尖細(xì)胞染色體畸變率差別不大，6×1017N+/cm2劑量處理下的染色體畸變率稍低于4×1017N+/cm2劑量處理下的染色體畸變率.而8×1017N+/cm2劑量處理下的染色體畸變率明顯提高.從表1中還可以看出，在相同劑量的處理下，紫粳四倍體水稻的畸變率稍高于二倍體水稻的畸變率.

表1 氮離子注入水稻根尖染色體畸變類型及畸變率

3 討論和結(jié)論

通過研究離子束注入對水稻根尖細(xì)胞及其染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響，探討了其在水稻誘變育種中的作用及機(jī)理.研究結(jié)果表明，經(jīng)過離子束注入后的根尖細(xì)胞比對照材料發(fā)生染色體異常行為的概率更高.這與前人在銀杏[10]、甜菊[11]和小麥[12]中的研究結(jié)果一致.有絲分裂后期出現(xiàn)染色體運(yùn)動滯后的原因，可能主要有以下幾個方面：染色體或染色單體斷片因沒有紡錘絲的牽引，在細(xì)胞分裂后期無法正常向細(xì)胞的兩極運(yùn)動，滯留在細(xì)胞的中央板附近；離子注入處理導(dǎo)致紡錘絲不健全或缺失，使部分染色體不能有效向極移動；由染色體錯接形成的具有兩個著絲粒的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，分裂后期難以正常分離，產(chǎn)生向極運(yùn)動的滯后現(xiàn)象.

染色體橋的出現(xiàn)可能是因?yàn)殡p著絲粒染色體的兩個著絲粒分別受到來自細(xì)胞兩極的紡錘絲牽引，在兩組子染色體相互分離時出現(xiàn)橋式結(jié)構(gòu)；或者是因?yàn)槿旧w末端相互黏連引起[13].

一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產(chǎn)生的.有實(shí)驗(yàn)證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核.這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核之外的核塊.當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核.如多個斷片與滯后染色體同時存在，它們在分裂末期可能因相距較遠(yuǎn)不能包被到同一微核內(nèi)，可使細(xì)胞中出現(xiàn)多個微核[14].

離子束注入引起水稻根尖細(xì)胞染色體異常的可能原因是，離子束作為一種新的誘變源，通過質(zhì)量沉積、能量沉積、電荷作用以及表面蝕刻作用對目標(biāo)細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)的分子結(jié)構(gòu)造成了不可逆的損傷，這種損傷的過程是通過離子束的物理作用轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿由系幕瘜W(xué)改變，繼而影響到生物化學(xué)上的功能性改變，這種改變最后被生物體的新陳代謝放大為生物學(xué)上的現(xiàn)象.

由此可見，離子注入可以引起水稻染色體異常，這是誘變產(chǎn)生變異部分的原因，也可能是其發(fā)生可遺傳性變異的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ).

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StudyonCytologicalEffectsofRiceImplantedwithIonBeam

DAI Xi-mei, ZHANG Jia-jia, YANG Xu, HUANG Qun-ce

(HenanProvincialKeyLaboratoryofIonBeamBio-engineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052，China)

The seeds of diploid and tetraploid rice were implanted by nitrogen ion beam.The cytological effects of the root tip cells were studied. The results showed that ion beam implantation could inhibit the survival rate and lots of types of chromosome aberration were observed in the mitosis of root tip cells of M0 generation,such as chromosome bridge,chromosome fragment,univalent and polyvalent. Chromosome aberration rate was not proportional to N+ion treatment dosages. But as a whole,the more of the dose,the higher of the chromosome aberration rate. The results proved that ion beam could cause abnormity of chromosomes,which might be the cytological reason that leading to the heritable mutations.

rice;ion beam implantation;mitosis;mutagenesis;chromosome

S 121

A

1671-6841(2011)04-0096-04

2011-03-09

河南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，編號2008A208019；農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目，編號200803034.

代西梅(1974-)，女，副教授，博士，主要從事植物遺傳育種研究，E-mail:daiximei@yahoo.com.cn.