血紅蛋白在Span 80/PEG 400/H2O囊泡體系中的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

王元有 華 偉 劉天晴,*

(1揚(yáng)州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225002;2揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225127)

血紅蛋白在Span 80/PEG 400/H2O囊泡體系中的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

王元有1,2華 偉1劉天晴1,*

(1揚(yáng)州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225002;2揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225127)

通過紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、動(dòng)態(tài)光散射、圓二色譜、負(fù)染-透射電鏡(NS-TEM)和冷凍蝕刻-透射電鏡(FE-TEM)等實(shí)驗(yàn)方法研究了血紅蛋白(Hb)與Span 80/PEG 400/H2O囊泡間的相互作用及其結(jié)構(gòu)特性.結(jié)果表明:Hb易于吸附在囊泡表面,使得囊泡的表觀半徑稍有增大;Hb的肽鏈在囊泡表面能夠逐漸伸開,特征熒光峰強(qiáng)度顯著增強(qiáng),部分氨基酸殘基進(jìn)一步暴露,α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加,無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量基本不變.囊泡體系中Hb的穩(wěn)定性與囊泡的穩(wěn)定性有關(guān).

血紅蛋白;結(jié)構(gòu);性質(zhì);非離子囊泡

1 引言

囊泡是分子有序組合體的一種重要形式,具有類似細(xì)胞膜的雙層膜結(jié)構(gòu)特性,因此它不僅可以用作細(xì)胞膜模型,也作為腫瘤和病毒的靶向藥物的載體,具有極其廣泛的應(yīng)用.1-11由非離子表面活性劑所形成的囊泡,不僅在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上與由脂質(zhì)體形成的囊泡相似,而且用于制備非離子型囊泡所用的材料具有相對(duì)較低的價(jià)格,制備簡(jiǎn)單、方便,12可進(jìn)行大批量生產(chǎn),也可避免不適合溶劑的選擇問題,因此非離子囊泡將具有更為廣闊的應(yīng)用前景.人們?cè)趹?yīng)用囊泡研究生物膜、藥物釋放、基因載體等過程中,常常僅研究其性質(zhì)、變化規(guī)律和效果,但囊泡對(duì)生命體系中蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響和囊泡與蛋白間的相互作用的研究報(bào)道較少,這一方面限制了人們對(duì)囊泡在生命體系中的功能和作為生物膜模擬模型的可靠性的深入理解和驗(yàn)證;另一方面,也限制了囊泡的功能性應(yīng)用的拓展.本文在成功地制備高穩(wěn)定、生物型Span 80/PEG 400/H2O非離子型囊泡基礎(chǔ)上,13通過紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜、圓二色譜、負(fù)染-透射電鏡、冷凍蝕刻-透射電鏡等方法,研究Span 80/PEG 400/H2O囊泡體系中的Hb結(jié)構(gòu)性質(zhì)及形貌,囊泡與蛋白間的相互作用,分析PEG 400對(duì)囊泡與蛋白間相互作用的影響,為生命體系中囊泡與蛋白間的相互作用與影響以及生物膜與蛋白間的相互關(guān)系等提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論指導(dǎo),為最終揭示生物膜與蛋白的作用機(jī)理提供了重要的范例,對(duì)生物膜的功能性研究和應(yīng)用也具有較深的理論與實(shí)際意義.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

血紅蛋白(Hb,BR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),Span 80(AR,上海大眾制藥廠),PEG 400(AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).水為二次蒸餾水.

2.2 非離子囊泡的制備

將Span 80、PEG 400和水按一定質(zhì)量比混合、振蕩,超聲10-15 min(CQX25-06超聲波清洗器,上海必能信超聲有限公司),制得非離子囊泡.通過影像分析(SK-882 Image Analyzer,Sanko Co.,Japan),觀察囊泡的大小、分布和穩(wěn)定時(shí)間.

2.3 紫外-可見吸收光譜的測(cè)定

配制一系列Span 80/PEG 400/H2O/Hb溶液,恒溫30 min,測(cè)定溶液的紫外吸收光譜(UV-2501PC紫外可見分光光度儀,Shimadzu Co.,Japan).

2.4 熒光發(fā)射光譜的測(cè)定

在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm,運(yùn)用RF-5301型熒光光譜儀(Shimadzu Co.,Japan)分別測(cè)定不同組成條件下Hb的熒光發(fā)射光譜.激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為3 nm.

2.5 冷凍蝕刻-透射電鏡

冷凍蝕刻-透射電鏡的樣品在冷凍蝕刻儀(Balzers BAF-400D)中制得模板后,通過透射電鏡(TEM, TECNAIL,Philip Apparatus Co.USA)觀察囊泡的形貌.14

2.6 負(fù)染-透射電鏡15

將含有囊泡的樣品滴在200目Formvar膜的載網(wǎng)上,吸附15 min后,進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染.通過透射電鏡(TECNAIL,Philip Apparatus Co.,USA)觀察囊泡的大小和形貌.

2.7 電導(dǎo)率的測(cè)定

體系的電導(dǎo)率由DDS-11A型電導(dǎo)率儀(上海第二分析儀器廠)測(cè)定.電導(dǎo)率儀每月均由0.01 mol· L-1KCl溶液校正.

2.8 圓二色性測(cè)定

蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)通過J-810型圓二色譜儀(Jasco Co.,Japan)測(cè)定蛋白體系的圓二色性(CD)而獲得.蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)由所得蛋白CD圖譜經(jīng)Jasco標(biāo)準(zhǔn)圖譜配合分析處理給出.掃描速率為100 nm·min-1.

2.9 Hb穩(wěn)定性的測(cè)定

測(cè)量一系列不同時(shí)間、不同血紅蛋白濃度時(shí)囊泡體系的紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜和圓二色譜,通過分析各峰強(qiáng)和位置是否變化,確定蛋白的穩(wěn)定性.

以上實(shí)驗(yàn)均在(25.0±0.1)°C條件下進(jìn)行.為了使各相互間作用達(dá)到穩(wěn)定平衡,體系穩(wěn)定時(shí)間至少為30 min.

3 結(jié)果與討論

3.1 Hb在Span 80/PEG 400/H2O囊泡體系中的紫外與熒光性質(zhì)

由于Hb在肽鏈上含有色氨酸殘基的吲哚環(huán)和酪氨酸殘基的苯環(huán),Hb紫外特征吸收峰主要落在276和406 nm.16在Hb/H2O體系中,隨著Hb濃度增加,其紫外-可見特征吸收峰的強(qiáng)度呈線性增加(圖1),這是紫外-可見光譜法測(cè)定Hb含量的基本原理. Hb在328 nm處的特征熒光發(fā)射峰強(qiáng)度,隨Hb濃度的增加,先增大到一極值后又減小.這可能是由于隨著Hb濃度增加,Hb可能發(fā)生二聚或團(tuán)聚現(xiàn)象,導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度下降.如果在PEG 400/H2O體系中加入Hb,Hb的紫外特征吸收峰強(qiáng)度和特征熒光發(fā)射峰強(qiáng)度與其在水體系中的性質(zhì)相比,沒有發(fā)生明顯變化.但在Span 80/PEG 400/H2O囊泡體系中,Hb特征熒光峰強(qiáng)度明顯增加.

PEG 400中含有較多親水基(羥基),呈完全水溶性,可與Hb中親水基(如氨基、羥基、羧基等)形成較強(qiáng)的氫鍵,聚集在Hb表面,但這種聚集沒有導(dǎo)致Hb結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化.在囊泡體系中,Hb與囊泡間的親水作用、疏水作用和氫鍵作用,導(dǎo)致Hb易于吸附在囊泡表面,Hb的肽鏈在囊泡表面可逐漸展開,部分氨基酸殘基可能更加暴露,特征熒光峰強(qiáng)度顯著地增強(qiáng).

圖1 三種不同體系中Hb紫外吸收強(qiáng)度(a)和熒光強(qiáng)度(b)與Hb濃度關(guān)系Fig.1 Relations of UV-Vis absorption intensity(a)and fluorescence emission intensity(b)of Hb variy with Hb concentrations in three different systems■H2O system,●PEG 400/H2O system,▲niosome system; Insets are UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b).107cHb/(mol·L-1):(1)7.00,(2)9.00,(3)0.100,(4)0.300,(5),0.500,(6)0.700,(7)0.900

3.2 Hb/囊泡的聚集形貌

Hb在囊泡表面吸附或聚集的圖像可以從囊泡/蛋白體系的FE-TEM照片(圖2)和NS-TEM照片(圖3、圖4)得到證實(shí).從圖2可以看出,在囊泡體系中加入Hb后,原本均勻的球形囊泡結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不均勻、多分散,不僅囊泡表觀體積增大,而且不規(guī)則球形數(shù)目也增多.從圖3、圖4可以看出,在含有一定量的囊泡體系中,隨著Hb濃度或PEG 400濃度的增加,囊泡逐漸相互連接在一起.大部分Hb通過親水作用和氫鍵,17在囊泡膜表面吸附,肽鏈在囊泡膜表面逐漸展開,體系中蛋白相互聚集的程度也不斷增加.隨著PEG 400含量的增加,囊泡與蛋白間的親水作用和氫鍵作用不斷增強(qiáng),蛋白在囊泡膜表面聚集增多,肽鏈進(jìn)一步展開.

圖2 囊泡體系(a)和Hb/囊泡體系(b)的冷凍蝕刻-透射電鏡(FE-TEM)照片F(xiàn)ig.2 FF-TEM images of niosome system(a)and Hb/niosome system(b)

3.3 Hb對(duì)囊泡半徑和ξ電位的影響

Span 80/PEG 400/H2O非離子囊泡半徑為80-150 nm,其大小主要與溫度、組成、制備方法等因素有關(guān).18隨著PEG 400含量增加,囊泡半徑逐漸減小(圖5).在含有Hb的囊泡體系中,囊泡的表觀半徑稍有增大,表明蛋白Hb吸附在囊泡膜表面.隨著PEG 400含量的增加,PEG 400與Hb間的氫鍵和親水作用能使更多PEG 400聚集在囊泡表面,囊泡表觀半徑稍有增加;但大量PEG 400又能引起囊泡膜的親水性增強(qiáng)而不穩(wěn)定,導(dǎo)致囊泡表觀半徑逐漸減小.圖5還表明,吸附在囊泡表面的Hb,對(duì)囊泡能起到屏蔽、保護(hù)作用,能顯著減小PEG 400對(duì)囊泡半徑及其穩(wěn)定性的影響.

PEG 400對(duì)囊泡/Hb體系中Hb、囊泡的動(dòng)電位和體系電導(dǎo)率均有影響.Span 80/PEG 400/H2O非離子型囊泡自身無電荷,動(dòng)電位為零,但當(dāng)該體系中含有Hb時(shí),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)囊泡呈現(xiàn)負(fù)電性、具有動(dòng)電位(圖6),其電荷性質(zhì)與蛋白Hb相同,這表明帶有負(fù)電性的Hb確實(shí)能吸附在非離子囊泡表面,使得非離子囊泡帶電性.從圖6還可以看出,隨著PEG 400含量增加,體系的電導(dǎo)率減小.PEG 400含量增加,體系粘度增強(qiáng),PEG 400與囊泡間的相互作用增強(qiáng),使得帶電粒子在電場(chǎng)下運(yùn)動(dòng)速率減小,電導(dǎo)率減小, Hb的表觀負(fù)電荷和動(dòng)電位也都減小.另外,PEG 400中羥基與蛋白間形成氫鍵,使Hb發(fā)生部分扭曲和伸長(zhǎng),電荷密度減小,二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,其電性也可能發(fā)生變化.

3.4 囊泡體系中Hb的園二色性及其二級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖3 Hb/囊泡體系NS-TEM照片F(xiàn)ig.3 NS-TEM images of Hb/niosome systemwPEG400=2.0%;106cHb/(mol·L-1):(a)1.00,(b)5.00,(c)8.00,(d)0.10,(e)0.30,(f)0.50

圖4 Hb/囊泡體系NS-TEM照片F(xiàn)ig.4 NS-TEM images of Hb/niosome systemcHb=5.00×10-6mol·L-1;wPEG400/%:(a)1.0,(b)2.0,(c)3.0,(d)4.0,(e)5.0,(f)7.0

在PEG 400/Span 80/H2O囊泡體系中,Hb的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯地變化,19,20α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加,無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量基本不變(圖7).由于蛋白與囊泡間親水作用、疏水作用和氫鍵作用使Hb能夠吸附于囊泡膜表面,蛋白的肽鏈在囊泡膜表面逐漸伸展.另外,PEG 400具有很強(qiáng)親水性,能夠嵌入到囊泡的膜相中,使得囊泡膜的親水性和粘性增強(qiáng),蛋白與囊泡間親水作用和氫鍵作用也增強(qiáng),蛋白在囊泡膜表面的含量增加,引起蛋白肽鏈折疊結(jié)構(gòu)松散,處于蛋白折疊結(jié)構(gòu)內(nèi)部的部分基團(tuán)暴露,甚至在囊泡膜表面進(jìn)一步展開,二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變.

3.5 Hb在PEG 400水溶液和囊泡體系中的穩(wěn)定性

圖5 PEG 400含量對(duì)囊泡半徑(Rh)的影響Fig.5 Effect of PEG 400 content on hydrodynamic radius(Rh)of niosome cHb=5.00×10-6mol·L-1

圖6 PEG 400含量對(duì)Hb/囊泡體系電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of PEG 400 content on conductivity ofniosome system cHb=5.00×10-6mol·L-1

圖7 PEG 400含量對(duì)囊泡體系中Hb的二級(jí)參數(shù)的影響Fig.7 Effect of PEG 400 content on secondary parameters of Hb in niosome systemcHb=5.00×10-6mol·L-1

圖8 Hb在囊泡體系中的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of Hb in niosome systemcHb=5.00×10-6mol·L-1;■Hb/niosome system,●Hb/PEG 400/H2O system

Hb對(duì)囊泡的大小和穩(wěn)定性影響較小,但囊泡的存在有利于Hb性質(zhì)的穩(wěn)定(圖8).由于Hb能夠吸附于囊泡膜表面,穩(wěn)定了蛋白的結(jié)構(gòu),部分保護(hù)了蛋白.所以,雖然Hb在囊泡體系中與在純水體系中相比其結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化,但其穩(wěn)定性顯著增加.從圖8還可看出,Hb的穩(wěn)定性隨著PEG 400含量的增加先增加、后下降,這可能與囊泡的穩(wěn)定性有關(guān).具有親水鏈的PEG 400環(huán)繞在囊泡中,部分存在于囊泡的膜相中,使得囊泡具有較高的穩(wěn)定性.另一方面,當(dāng)體系中PEG 400含量較高時(shí),PEG 400含量增加使得囊泡的親水性增加,囊泡膜厚度減小,囊泡穩(wěn)定性減小,引起Hb結(jié)構(gòu)變化、穩(wěn)定性降低.

4 結(jié)論

在PEG 400/Span 80/H2O囊泡體系中,Hb能夠吸附于囊泡膜表面,使得蛋白的肽鏈在囊泡膜表面逐漸伸展,二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,Hb電性質(zhì)和穩(wěn)定性也發(fā)生改變.隨著PEG 400含量的增加,囊泡與蛋白間相互作用逐漸增強(qiáng),蛋白在囊泡膜表面聚集增多.Hb在Hb/囊泡體系中的穩(wěn)定性較在Hb/H2O體系中的穩(wěn)定性高.而當(dāng)?shù)鞍诐舛戎饾u增加時(shí),越來越多的囊泡通過蛋白而相互聚集.研究非離子型表面活性劑囊泡體系中的蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì),囊泡與蛋白間的相互作用,分析PEG 400對(duì)囊泡與蛋白間相互作用的影響,能夠?yàn)樯w系中囊泡與蛋白間的相互作用與影響以及生物膜與蛋白間的相互關(guān)系等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),也能夠?yàn)樯锬さ墓δ苄匝芯亢蛻?yīng)用提供可靠的理論依據(jù).

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February 28,2011;Revised:May18,2011;Published on Web:June 21,2011.

Structural Property of Hemoglobin in Span 80/PEG 400/H2O Niosome System

WANG Yuan-You1,2HUA Wei1LIU Tian-Qing1,*
(1School of Chemistry and Chemical Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225002,Jiangsu Province,P.R.China;2Department of Chemical Engineering,Yangzhou Polytechnic Institute,Yangzhou 225127,Jiangsu Province,P.R.China)

The structural property of hemoglobin(Hb)was studied in detail by UV-Vis absorption, fluorescence,circular dichroism,negative staining-transmission electron microscopy(NS-TEM),and freeze etching-transmission electron microscopy(FE-TEM)techniques using a Span 80/PEG 400/H2O niosome system.The obtained results show that Hb is adsorbed onto the surface of niosome.The peptide chain of Hb spreads out and the apparent radius of the niosome,the intensities of the UV-Vis absorption peaks,and the fluorescence peaks increase.For the second structural parameter of Hb,the α-helix content decreases but the β-sheet and β-turn content increases.The stability of Hb varies with that of the niosome.

Hemoglobin;Structure;Property;Niosome

O648

*Corresponding author.Email:tqliu@yzu.edu.cn;Tel:+86-514-87975590-9517;Fax:+86-514-87975244. The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20573091).

國(guó)家自然科學(xué)基金(20573091)資助項(xiàng)目