不同營養(yǎng)方式對普通小球藻生長特性和細胞組成的影響*

曹云濤，孔維寶，，葸玉琴，李龍囡，夏春谷

1(西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州，730070)

2(中科院蘭州化學物理研究所，羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅蘭州，730000)

小球藻屬綠藻門(Chlorophyta)綠藻綱(Chlorophyceae)綠球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻屬(Chlorolla)，是一類普生性單細胞藻類［1］。常見的有蛋白核小球藻(C．pyrenoidosa)、橢圓小球藻(C．ellipsoidea)、普通小球藻(C．vulgaris)等［2］。小球藻含豐富的蛋白質、脂質、多糖、食用纖維、維生素、微量元素和活性代謝產物，具有降血壓、降血脂，抗動脈粥樣硬化，增強免疫力，抗腫瘤以及抗病毒感染等保健功能［3］。

小球藻除了可以利用光能和CO2進行光合自養(yǎng)以外還可以利用一種或多種有機物作為能源和碳源在黑暗中生長［4］，即進行異養(yǎng)繁殖，類似于細菌的發(fā)酵。除此之外，它還可以在光照條件下，利用有機碳源進行混合營養(yǎng)生長，而且生長速度和藻密度較高。由于小球藻的這一特性及其較高的應用價值，異養(yǎng)和混合營養(yǎng)方式成為微藻生物技術領域的研究熱點［5］。目前，有關小球藻培養(yǎng)的研究國內外主要集中在自養(yǎng)和異養(yǎng)方面［6］，但是對自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)三者之間的比較研究，特別是較為系統(tǒng)地研究微藻的混養(yǎng)特性的報道相對較少。本研究通過比較分析不同營養(yǎng)模式下小球藻的生長特性和細胞組成的變化，以期獲得高密度培養(yǎng)小球藻的理想模式，為充分利用這一微藻資源提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻種

普通小球藻(Chlorella vulgaris)，購自中科院水生生物研究所淡水藻種庫。

1.1.2 試劑

NaHCO3、葡萄糖、正己烷和培養(yǎng)基營養(yǎng)鹽等均為分析純試劑。

1.1.3 SEM培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基為土壤浸出液培養(yǎng)基(g/L):0.250 NaNO3、0.075 K2HPO4· 3H2O、、0.075 MgSO4·7H2O、0.025 CaCl2·2H2O、0.175 KH2PO4、0.025 NaCl、0.005FeCl3· 6H2O，1.0 mL Fe-EDTA、A5 溶液(組分為:2.860 H3BO3、1.810 MnCl2·H2O、0.222 Zn-SO4·7H2O、0.079 CuSO4· 5H2O、0.390 Na2MoO4·2H2O):1.0 mL/L、土壤浸出液:40.0 mL/L。

1.2 儀器與設備

TDL－5000B低溫冷凍離心機;LDZX－40B1型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安;電子天平，日本島津;恒溫光照搖床，江蘇太倉;超凈工作臺，江蘇蘇凈;日立UV－1800可見紫外分光光度計;酸度計，美國奧利龍;溶氧儀，上海雷磁;GY92－2D超聲波細胞破碎儀，浙江寧波;旋轉蒸發(fā)儀，河南鞏義;電熱烘箱，上海一恒。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設計

實驗分為自養(yǎng)、異養(yǎng)、混養(yǎng)3組，每組又根據(jù)不同碳源濃度設2個處理，3個平行。所有處理均在100 mL SEM培養(yǎng)基中接種10mL對數(shù)生長期藻液，各處理分別添加不同碳源和光照處理(見表1)。

表1 實驗設計表

1.3.2 培養(yǎng)方法

調培養(yǎng)基pH至7.2后分裝，121℃高壓滅菌20 min(NaHCO3經紫外滅菌后添加于冷卻培養(yǎng)基中以防分解和產生沉淀)。無菌條件下吸取對數(shù)生長期的藻液10 mL接入100 mL培養(yǎng)液中，搖勻后置于光照恒溫搖床中培養(yǎng)，自養(yǎng)和混養(yǎng)組直接暴露于光下，異養(yǎng)組用雙層黑塑料袋遮光處理。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，搖床轉速為120 r/min，光強度為2 500 Lux，光周期為12 L:12 D，培養(yǎng)6 d。

1.3.3 測定方法

1.3.3.1 藻密度測定方法

采用濁度比色法測定藻密度，每12 h從培養(yǎng)瓶中取一定量藻液適當稀釋后測660 nm處吸光值，根據(jù)標準曲線［Y(g/L)=0.385 1×A660－0.017(R2=0.996 7)］計算質量濃度(g/L)。根據(jù)公式:μ=［(ln Xt－ln X0)/(t－t0)］×2.303(其中 X0、Xt分別為對數(shù)生長期始末的吸光值，t、t0為相對應的培養(yǎng)時間)求比生長速率;并根據(jù)培養(yǎng)時間、密度和體積等參數(shù)計算產率。

1.3.3.2 pH值的測定

pH采用酸度計測定。每48h于無菌條件下測定各處理培養(yǎng)液中的pH值。

1.3.3.3 葡萄糖含量的測定

殘?zhí)呛康臏y定采用蒽酮比色法［7］，根據(jù)標準曲線方程［Y(μg)=321.94 A620+0.804(R2=0.999 4)］計算葡萄糖含量。

1.3.3.4 光合色素含量的測定

采用三波長比色法［8］。

1.3.3.5 可溶性蛋白質含量的測定方法

采用考馬斯亮藍染色法［8］。培養(yǎng)結束后的藻液在4 000 r/min下離心10 min，用無菌水洗滌藻泥3次，用100 mmol/L NaCl溶液稀釋藻泥，并進行細胞破碎(400 W，20 min，超聲5 s，間歇1 s)，破碎液于4 000 r/min離心10 min后取上清測定可溶性蛋白質含量，根據(jù)標準曲線方程［Y(μg)=92.513 A595－0.7613(R2=0.9996)］計算可溶性蛋白質含量。

1.3.3.6 油脂含量的測定

采用正己烷提取-稱重法。4 000 r/min離心10 min收集培養(yǎng)結束的藻液，蒸餾水洗滌2次，離心收集藻泥并于70℃烘干至恒重;將干藻體用小型研磨器充分研磨至細粉，用正己烷反復抽提5次，每次振蕩提取1h，合并提取液，45℃旋轉蒸發(fā)回收溶劑后在70℃烘干至恒重，稱重計算油脂含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗組均設置3個平行，所列數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS13.0統(tǒng)計分析，均為3次平行測定的平均值，以平均值±標準偏差(Mean±Std)表示。表中同一行數(shù)據(jù)中不同字母代表在a=0.05水平上存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同營養(yǎng)方式對小球藻生長特性的影響

采用自養(yǎng)、異養(yǎng)和混合營養(yǎng)3種方式對小球藻進行培養(yǎng)，在相同條件下對其生長過程中的動態(tài)變化進行檢測，結果見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)方式對小球藻生長的影響

從圖1可以看出，3種營養(yǎng)方式中，異養(yǎng)和混合營養(yǎng)的生長速率明顯優(yōu)于自養(yǎng)。而在異養(yǎng)和混養(yǎng)兩者中，后者又表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，尤其是在生長的穩(wěn)定期，異養(yǎng)方式因為能源物質消耗殆盡，進入衰退期，而混養(yǎng)卻生長強勁，增長速度平穩(wěn)。這是由于混合營養(yǎng)兼有自養(yǎng)和異養(yǎng)的特點，即在基質中葡萄糖消耗完以后小球藻可進行自養(yǎng)代謝，使得藻細胞繼續(xù)生長［9］。

碳源是影響小球藻生長的重要因素。從圖1中可以看出，對于每一種營養(yǎng)方式，較高濃度的碳源可以在一定程度上提高小球藻的生長速度和生物量的積累，而異養(yǎng)和混合營養(yǎng)在生長后期的差別也從另一個方面說明葡萄糖作為碳源對小球藻生長有促進作用，葡萄糖的存在可能彌補了氣體碳源CO2供應的不充足，并可能使細胞在碳源利用中節(jié)省所消耗的ATP和NADPH［10－11］。光照作為另一個影響小球藻生長的因素，其重要性在本實驗中也得到證實。另外在一個光暗培養(yǎng)周期中，光照條件下小球藻的生長也略快于黑暗條件下。這說明光能夠促進碳源的代謝和能量的輸送［12］，利于混合營養(yǎng)的進行。

由表2可以看出異養(yǎng)和混合營養(yǎng)的比生長速率明顯高于自養(yǎng)，分別是其4.25～5.45倍和4.25～4.28倍，這也進一步說明了圖1的結論。而從平均產率來看，混合營養(yǎng)優(yōu)勢更加明顯，其產率為3種營養(yǎng)方式中最高，分別是自養(yǎng)、異養(yǎng)的5.79～6.27倍和1.11～1.31倍。因此，混合營養(yǎng)是獲得小球藻高密度、高產量、短周期培養(yǎng)的最佳營養(yǎng)方式。

表2 不同營養(yǎng)方式對小球藻比生長速率及產率的影響

2.2 不同的營養(yǎng)方式下培養(yǎng)基的pH和葡萄糖含量變化

pH是影響藻類生長代謝的重要因子之一，培養(yǎng)基的pH值會影響光合作用中CO2的可用性，在呼吸作用中會影響微藻對有機碳源的利用效率，同時由于pH值直接影響細胞膜的滲透性，會影響微藻細胞對培養(yǎng)液中離子的吸收和利用，以及代謝產物的再利用性和毒性［13－14］。圖2為不同營養(yǎng)方式下培養(yǎng)基中pH的變化情況。

圖2 不同營養(yǎng)方式對小球藻培養(yǎng)基pH值的影響

可以看出自養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中pH總體處于增長的趨勢且一直保持在堿性范圍。這是由于自養(yǎng)條件下小球藻光合作用強烈，隨著細胞的增殖而不斷消耗培養(yǎng)基中由 NaHCO3產生的 CO2，導致HCO3－解離。異養(yǎng)條件下pH表現(xiàn)為先降后升，但變化范圍不大，這是因為小球藻在異養(yǎng)條件沒有光能無法利用環(huán)境中的CO2，導致CO2積累，培養(yǎng)基酸性增加。而混合營養(yǎng)pH值介于自養(yǎng)和異養(yǎng)之間，并且有明顯的升降變化，這表明混合營養(yǎng)條件下，細胞的光合作用和呼吸代謝強度存在相互競爭和補助，即呼吸代謝產生的CO2會被光合途徑中的CO2泵回收重新利用?；旌蠣I養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中pH的變化可能與葡萄糖代謝副產物的某些小分子有機酸有關［15］。另外，碳源濃度對pH的影響也可從圖2中體現(xiàn)出來，異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下較高濃度的碳源抑制了培養(yǎng)基中pH的上升，自養(yǎng)條件下則表現(xiàn)為促進作用。

圖3為混合營養(yǎng)和異養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中葡萄糖含量隨培養(yǎng)時間的消耗情況?？梢钥闯龌旌蠣I養(yǎng)和異養(yǎng)對培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗趨勢大體相當。但是圖3中也反映出混合營養(yǎng)和異養(yǎng)之間仍有輕微差異，這可能是因為混合營養(yǎng)有光合作用和呼吸作用產生的CO2回補效應，致使對葡萄糖的消耗不如異養(yǎng)強烈。

圖3 培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中葡萄糖含量的變化

2.3 不同營養(yǎng)方式對小球藻光合色素含量的影響

圖4為不同營養(yǎng)方式下小球藻葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素含量的變化。由圖4可知，不同營養(yǎng)方式下自養(yǎng)方式積累的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素明顯高于異養(yǎng)和混合營養(yǎng)方式;而異養(yǎng)和混合營養(yǎng)相比較，后者光合色素的含量較高。但是自養(yǎng)方式下小球藻的生物量很低，所以其光合色素總量很低。實驗中還發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)條件下的藻液呈淡黃色，這與小球藻在異養(yǎng)轉化過程中出現(xiàn)葉綠素逐漸消失、細胞呈黃化的現(xiàn)象有關［16］，也有報道稱小球藻的營養(yǎng)方式在從自養(yǎng)向異養(yǎng)轉換過程中，細胞中葉黃素的含量會增加［17］。

圖4(a)和圖4(b)為不同營養(yǎng)方式對小球藻細胞中葉綠素a和葉綠素b的影響。可以看出異養(yǎng)和混合營養(yǎng)條件下單位質量小球藻細胞中葉綠素a和葉綠素b的含量均有所下降，其中異養(yǎng)下降的更為明顯。而在這兩種營養(yǎng)方式下，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度越高葉綠素a、b含量反而越低，這表明葡萄糖不利于光合色素的合成，有機碳作為混養(yǎng)和異養(yǎng)的碳源可能對微藻的光合活性造成一系列影響［18］。因為光照的原因，自養(yǎng)和混合營養(yǎng)條件下葉綠素a和葉綠素b的含量隨小球藻細胞的生長和細胞數(shù)目的增多而提高，其總量的積累也隨之增多，而葉綠素a含量增加的更快;而在異養(yǎng)條件下，小球藻中葉綠素a、b的含量表現(xiàn)為下降，這是因為細胞不能在黑暗中合成葉綠素，隨著細胞分裂的進行，單個細胞內的葉綠素含量越來越少［19］。圖4(c)為不同營養(yǎng)方式下小球藻中總葉綠素含量的變化。由圖看以看出，總葉綠素含量的變化趨勢和圖4(a)圖4(b)的相同。

圖4 不同營養(yǎng)方式對小球藻光光合色素含量的影響

由圖4(d)可知，不同營養(yǎng)方式對單位質量小球藻中類胡蘿卜素含量的影響也很明顯，不同培養(yǎng)方式中以自養(yǎng)條件下類胡蘿卜素的含量最高，混合營養(yǎng)次之。而在相同的培養(yǎng)方式條件下，碳源的濃度同樣對小球藻中類胡蘿卜素的含量也有影響，表現(xiàn)為高濃度葡萄糖輕微抑制類胡蘿卜素的合成。

對不同營養(yǎng)方式下小球藻總葉綠素含量和產率分析見表3?？梢钥闯觯瑔挝毁|量小球藻中總葉綠素的含量和產率都以自養(yǎng)為最高，但是由于自養(yǎng)方式下的細胞密度較低，故其總產量也較低，所以自養(yǎng)條件下單位體積藻液中所含總葉綠素較混合營養(yǎng)的低，而單位體積藻液中總葉綠素的產率以混合營養(yǎng)的最好。所以混合營養(yǎng)條件下隨著細胞密度增大，葉綠素濃度也增加，葉綠素濃度與細胞密度變化大致存在相同的變化趨勢。

2.4 不同營養(yǎng)方式對小球藻蛋白質含量的影響

表4中比較了不同營養(yǎng)方式下單位質量、單位體積蛋白質含量以及產率的差異。從表4可以看出，單位質量蛋白質含量以自養(yǎng)方式下為最高，達到43.28%，這與李師翁等的［20］研究結果相一致。但是因自養(yǎng)生物量低的緣故，所以單位體積含量則表現(xiàn)為最低;而混合營養(yǎng)方式因為其生物量大，細胞密度高，其單位體積蛋白質含量在不同營養(yǎng)方式中為最高，相應的其產率也為最高。細胞在生長的前期，主要是利用培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質進行分裂繁殖，增加生物量。當營養(yǎng)鹽消耗將盡，生物量積累到一定程度后，細胞進人生長的平衡期，此時，開始大量分泌次級代謝產物，胞內蛋白質的合成與積累主要在此期間進行［21］。而混合營養(yǎng)方式因為自身的優(yōu)點，能夠在小球藻生物量增加以后仍提供營養(yǎng)支持，延長平衡期，以利于胞內蛋白的積累，所以混合營養(yǎng)同樣也是高密度培養(yǎng)小球藻的前提下獲得高蛋白含量的最佳營養(yǎng)方式。

表3 不同營養(yǎng)方式對小球藻葉綠素含量和產率的影響

表4 不同營養(yǎng)方式對小球藻蛋白質含量和產率的影響

2.5 不同營養(yǎng)方式對小球藻油脂含量的影響

表5為不同營養(yǎng)方式下小球藻油脂含量的比較，從表5中可以看出，對于3種營養(yǎng)方式在單位質量、單位體積和產率3個方面，混合營養(yǎng)條件下小球藻油脂積累量為最高，并且明顯優(yōu)于自養(yǎng)和異養(yǎng)方式。尤其是混合營養(yǎng)條件下，高濃度的碳源有利于油脂的積累，其油脂含量達到13%，產率也達到了44.65mg/(L·d)，這與有關報道相符合［22］。從其他2種營養(yǎng)方式中也可以看出，高濃度的碳源對小球藻細胞中油脂的積累有促進作用，這是因為碳源濃度的提高刺激了小球藻的生長，使得小球藻油脂積累進程加快，產率也得以提高。所以混合營養(yǎng)方式也是小球藻獲得高油脂含量的最佳培養(yǎng)方式。據(jù)桂林等［23］報道，采用自養(yǎng)、異養(yǎng)和混合營養(yǎng)培養(yǎng)蛋白核小球藻時發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)條件下粗脂肪含量最高，這和本實驗有出入。這可能是由于藻種的不同或培養(yǎng)基不同的原因所致，因為小球藻油脂含量的高低同時還受基質pH、鹽度、C/N、營養(yǎng)鹽等因素的影響［24－26］。

表5 不同營養(yǎng)方式對小球藻油脂含量和產率的影響

3 討論

本文比較研究了自養(yǎng)、異養(yǎng)、混合營養(yǎng)不同培養(yǎng)條件下，普通小球藻的生長特性和細胞組成，考察了不同營養(yǎng)方式下小球藻的比生長速率及產率、培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中pH和葡萄糖含量、光合色素含量、蛋白質含量、油脂含量等方面的差異。結果表明，混合營養(yǎng)培養(yǎng)是高密度，高生物活性物質培養(yǎng)小球藻的最佳方式。在混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件下小球藻的比生長速率和產率為最大，單位體積所合成的光合色素含量高，并且其蛋白質和油脂產率也較自養(yǎng)和異養(yǎng)方式下的高。自養(yǎng)條件下單位質量的藻體可獲得較高的光合色素和蛋白質含量，但其最大的缺點是生物量太低。雖然異養(yǎng)培養(yǎng)使小球藻生物量有了很大提高，但是異養(yǎng)型微藻的種類相對較少［4］。

目前小球藻大規(guī)模培養(yǎng)多使用開放式或封閉式池塘培養(yǎng)系統(tǒng)(即自養(yǎng)方式)，這種培養(yǎng)系統(tǒng)成本較低，但自養(yǎng)方式下生物量太低，油脂含量也不高，且易污染。異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻為擴大其生產規(guī)模開辟了廣闊的前景，但是目前報道的異養(yǎng)微藻的種類相對較少。研究表明，混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件下小球藻的生物量、光合色素、蛋白質和油脂產率相對較高，所以混養(yǎng)方式為生產高密度、高品質微藻提供了一種理想模式，而且混合營養(yǎng)方式更加符合微藻生長的實際環(huán)境，可培養(yǎng)的微藻種類相對較多［27］，具有規(guī)模化生產的潛在應用價值。

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