超高效合相色譜(UPC2)技術(shù)快速測(cè)定植物油中的維生素A和維生素E

彭嬿雯，王 波，劉阿靜，王瑩捷，把靈珍，韓舜愈，管賢賢，周小平

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730070； 2.蘭州海關(guān)技術(shù)中心，蘭州730000；3.西北師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，蘭州730070)

維生素A與維生素E是人體正常代謝和功能所必需的脂溶性維生素，其中：維生素A(視黃醇)的主要功能是參與視覺(jué)細(xì)胞視紫紅質(zhì)的合成[1]，維持人類(lèi)視覺(jué)與骨骼的健康，促進(jìn)細(xì)胞的分裂識(shí)別以及維護(hù)免疫系統(tǒng)的完整性；維生素E具有防癌、抗氧化、抗衰老等功效[2-4]，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同其分為α-、β-、γ-、δ-生育酚(Tocopherol, T)和生育三烯酚(Tocotrienol, T3)[5]，其中α-生育酚的生物活性最強(qiáng)，其次為β-、γ-生育酚，δ-生育酚的生物活性最弱，抗氧化能力強(qiáng)弱則是α-生育酚<β-生育酚<γ-生育酚<δ-生育酚[6-7]。植物油中含有豐富的天然維生素E，是人體從外界食物中獲取維生素E的主要來(lái)源，研究建立同時(shí)快速檢測(cè)植物油中維生素A和維生素E的方法，除了對(duì)鑒定植物油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)具有重要意義外，同時(shí)能更好地評(píng)估人體從膳食攝入這兩種營(yíng)養(yǎng)素的狀況。

目前，測(cè)定脂溶性維生素A和維生素E的方法主要有分光光度法[8]、電化學(xué)法[9-10]、氣相色譜法[11]、高效液相色譜法[12]、液質(zhì)聯(lián)用法[13]等。其中高效液相色譜法(HPLC)應(yīng)用最廣泛，如：姜波等[14]建立了HPLC同時(shí)測(cè)定植物油中維生素A和不同構(gòu)型維生素E含量的方法，但β-維生素E和γ-維生素E的保留時(shí)間一致，不能分離；喬坤云[15]、王暉[16]、陳春曉[17]等采用反相HPLC對(duì)不同食品中維生素A和維生素E含量進(jìn)行測(cè)定，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，樣品前處理需要經(jīng)過(guò)皂化處理，無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速分離檢測(cè)的目的。劉瑩等[18]建立了固相萃取-在線二維快速同時(shí)測(cè)定食品中維生素A、D和4種維生素E異構(gòu)體的含量，實(shí)現(xiàn)了4種維生素E異構(gòu)體的有效分離，樣品前處理方法使用固相萃取代替液液萃取，簡(jiǎn)化了前處理操作步驟，提高了檢測(cè)效率。反相HPLC無(wú)法分離β-維生素E和γ-維生素E，樣品需經(jīng)過(guò)皂化，操作煩瑣，而正相HPLC雖然可實(shí)現(xiàn)維生素E各種異構(gòu)體的分離[19]，但流動(dòng)相揮發(fā)性強(qiáng)，溶劑強(qiáng)致癌，對(duì)儀器損耗較大。因此，建立快速高效的維生素A和維生素E檢測(cè)方法具有重要意義。

超高效合相色譜(UPC2)作為一種新型色譜分離技術(shù)，可分析不適用氣相色譜(GC)分析的高沸點(diǎn)樣品，又比傳統(tǒng)的HPLC分析速度快，且具有有機(jī)溶劑使用量少、重現(xiàn)性好、綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)[20-22]。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用UPC2技術(shù)，對(duì)不同植物油樣品中的脂溶性維生素A和維生素E(大量文獻(xiàn)表明，植物油中δ-生育酚含量較少，對(duì)總維生素E含量貢獻(xiàn)不大，故本文只對(duì)α-、β-、γ-生育酚進(jìn)行研究)進(jìn)行測(cè)定，以期建立一種快速高效的分離檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

26份植物油樣品，主要來(lái)自實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存以及當(dāng)?shù)爻小?/p>

維生素A標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.3%)、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.4%)、β-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥96%)、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥96%)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；異丙醇、甲酸、乙腈、甲醇，均為色譜純，德國(guó)Merck公司；無(wú)水乙醇、正己烷，均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)；屈臣氏飲用水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司；CO2(純度>99.997%)，蘭州匯能公司。

Acquity UPC2儀，美國(guó)Waters公司；電子天平(±0.01 g)；分析天平(±0.000 1 g)，德國(guó)Sartorius公司；3K30冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；MS3渦旋儀，德國(guó)IKAMS3公司；移液槍(100～1 000 μL、20～100 μL)，美國(guó)Thermo Electron公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g(精確至0.000 1 g)，用異丙醇準(zhǔn)確定容至100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃避光儲(chǔ)存，使用期限不超過(guò)3個(gè)月。

分別取一定體積的維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相(助溶劑)配制成維生素A質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L，α-生育酚、γ-生育酚質(zhì)量濃度均為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L，β-生育酚質(zhì)量濃度為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取3.00 g植物油樣品(精確至0.01 g)于50 mL聚乙烯塑料離心管中，加入提取溶劑異丙醇定容至10 mL。渦旋振蕩5 min，充分混勻后取1.5 mL上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后裝入棕色進(jìn)樣小瓶中，直接進(jìn)行UPC2測(cè)定(整個(gè)過(guò)程中避光)。

1.2.3 UPC2色譜條件

HSS C18SB色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A為CO2，流動(dòng)相B(助溶劑)為0.2%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；動(dòng)態(tài)背壓13.1 MPa；柱溫50℃；進(jìn)樣量1.0 μL。數(shù)據(jù)處理使用Empower 3軟件。在對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，只改變其中一個(gè)變量的值，其他條件不變。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

為了使4種脂溶性維生素(維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚)能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的分離，本實(shí)驗(yàn)比較了2種填料的UPC2色譜柱HSS C18SB(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)和CSH Fluoro-Phenyl(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)對(duì)目標(biāo)物分離的影響。HSS C18SB色譜柱填裝了高強(qiáng)度硅膠顆粒，有利于脂溶性維生素、堿性類(lèi)物質(zhì)的分離，CSH Fluoro-Phenyl色譜柱固定相表面帶電雜化顆粒，適用于天然產(chǎn)物的分離[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CSH Fluoro-Phenyl色譜柱無(wú)法有效分離4種脂溶性維生素，其色譜峰均互相包埋或形成肩峰，而HSS C18SB色譜柱在5 min之內(nèi)可實(shí)現(xiàn)4種脂溶性維生素的有效分離(見(jiàn)圖1)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用HSS C18SB作為分析色譜柱。

圖1 HSS C18 SB色譜柱分離4種脂溶性維生素的色譜圖

2.1.2 助溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了4種不同極性的助溶劑甲醇、乙腈、異丙醇、乙醇對(duì)4種脂溶性維生素分離效果的影響。結(jié)果表明，隨著助溶劑極性的降低，流動(dòng)相的洗脫能力和選擇性也發(fā)生了相應(yīng)的變化，使用乙腈、乙醇作為助溶劑時(shí)，無(wú)法將4種脂溶性維生素很好地洗脫出來(lái)甚至不出峰，使用異丙醇作為助溶劑時(shí)，基線發(fā)生嚴(yán)重的漂移，使用甲醇作為助溶劑時(shí)，4種維生素可達(dá)到分離的目的。為了增強(qiáng)維生素在色譜柱上的保留效果，改善峰形，在助溶劑甲醇中加入甲酸以改變流動(dòng)相的酸性環(huán)境，實(shí)驗(yàn)比較了3種不同體積分?jǐn)?shù)(0.05%、0.1%、0.2%)的甲酸甲醇溶液對(duì)4種脂溶性維生素峰形的影響。結(jié)果表明，0.05%甲酸甲醇溶液和0.1%甲酸甲醇溶液基本未改變4種脂溶性維生素的峰形，而0.2%甲酸甲醇溶液對(duì)4種脂溶性維生素的峰形均有較好的改善。因此，選用0.2%甲酸甲醇溶液作為助溶劑。

2.1.3 色譜柱溫度的選擇

色譜柱的溫度(柱溫)對(duì)目標(biāo)物的分離度和保留時(shí)間均有一定的影響，當(dāng)柱溫升高、背壓減小時(shí),超臨界CO2密度變小，化合物的保留時(shí)間延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)考察了柱溫在30、35、40、45、50、55℃時(shí)對(duì)4種脂溶性維生素分離的影響。結(jié)果表明：柱溫低于40℃時(shí)，只能分離出3種脂溶性維生素；柱溫為45℃時(shí)，α-生育酚和β-生育酚分離不完全，出現(xiàn)拖尾；柱溫為50℃時(shí)，4種脂溶性維生素完全分離，且峰形良好?？紤]到柱子的使用情況以及實(shí)際樣品的分離度、系統(tǒng)壓力等因素，最終選擇色譜柱溫度為50℃。

2.1.4 流速的選擇

流速也是影響目標(biāo)物峰形和保留時(shí)間的重要因素之一。隨著流速的增大，目標(biāo)物的出峰時(shí)間提前，峰形變得尖銳，但是流速過(guò)大容易造成柱壓過(guò)高，影響峰形，縮短色譜柱的使用壽命；較小的流速會(huì)造成分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，峰展寬較大，影響靈敏度。本實(shí)驗(yàn)在0.8～1.5 mL/min范圍內(nèi)對(duì)流速進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，分離時(shí)間延長(zhǎng),無(wú)法達(dá)到快速分離的目的，當(dāng)流速為1.2 mL/min時(shí)，α-生育酚和β-生育酚分離不完全。因此，選擇1.0 mL/min為最佳流速。

2.2 樣品前處理提取溶劑的選擇

按1.2.2方法，分別用正己烷、異丙醇、甲醇作為提取溶劑，通過(guò)比較4種脂溶性維生素的峰面積評(píng)價(jià)3種溶劑對(duì)植物油中目標(biāo)物的提取效果，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取溶劑對(duì)4種脂溶性維生素的提取效果

由圖2可見(jiàn)，甲醇對(duì)植物油中維生素A和維生素E的提取率最低，其次是正己烷，而異丙醇的提取率最高。計(jì)算結(jié)果表明，正己烷、異丙醇、甲醇作為提取溶劑時(shí)，維生素A峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.61%、3.08%、2.35%，α-生育酚峰面積的RSD分別為2.42%、1.93%、2.79%，β-生育酚峰面積的RSD分別為3.11%、2.28%、3.50%，γ-生育酚峰面積的RSD分別為3.52%、3.02%、3.34%。異丙醇提取4種脂溶性維生素時(shí)峰面積的RSD相對(duì)較好，因此選擇異丙醇作為樣品中4種脂溶性維生素的提取溶劑。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系、方法檢出限和定量限

將維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行UPC2測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。同時(shí)，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，以10倍信噪比計(jì)算定量限，結(jié)果如表2所示。

表2 維生素A和維生素E的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

由表2可見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.999 5及以上，說(shuō)明4種脂溶性維生素在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，方法的檢出限和定量限分別為0.1～1.5 mg/L和1.0～5.0 mg/L。

2.3.2 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取空白樣品3.00 g(精確至0.01 g)于離心管中，分別添加低、中、高3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2.2的方法進(jìn)行前處理，按1.2.3條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率及RSD，結(jié)果如表3所示。

表3 樣品加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

由表3可見(jiàn)，3個(gè)不同加標(biāo)水平的回收率在82.00%～106.82%之間，RSD在0.94%～3.57%之間，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.3 精密度

取質(zhì)量濃度為50.0 mg/L的4種脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)工作液于一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄4種脂溶性維生素的峰面積并計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果表明，維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚峰面積的RSD分別為2.08%、1.94%、3.51%和2.72%。同樣取質(zhì)量濃度為50.0 mg/L的4種脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)工作液，每天進(jìn)樣測(cè)定3次，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3 d，記錄4種脂溶性維生素的峰面積并計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果表明，維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚峰面積的RSD分別為3.97%、5.13%、3.74%和4.66%，說(shuō)明本方法的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性

精密稱取3.00 g植物油樣品6份，按照1.2.2的方法進(jìn)行樣品前處理，按1.2.3條件進(jìn)行測(cè)定，記錄4種脂溶性維生素對(duì)應(yīng)的峰面積并計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果表明，維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚峰面積的RSD分別為2.25%、3.80%、3.31%和3.69%，說(shuō)明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性

取同一供試樣品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h按1.2.3條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果表明，維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚峰面積的RSD分別為3.12%、2.82%、4.04%和2.97%，表明該方法的樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用優(yōu)化的樣品前處理方法及色譜條件對(duì)26份植物油樣品中的維生素A和維生素E含量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)植物油樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 26份植物油樣品中維生素A和維生素E含量的測(cè)定結(jié)果 mg/kg

由表4可知：在所檢測(cè)的26份油樣中，大豆油、橄欖油、花生油、菜籽油、葵花籽油含有α-生育酚和γ-生育酚，不含β-生育酚和維生素A，其中葵花籽油中α-生育酚含量最高，為561.57 mg/kg，大豆油中γ-生育酚含量最高，為532.17 mg/kg，橄欖油中主要以α-生育酚為主，而菜籽油中主要以γ-生育酚為主；玉米油、火麻油、芥末調(diào)味油中不含維生素A，但含有α-生育酚、β-生育酚和γ-生育酚3種組分，且主要以γ-生育酚為主，平均含量約700 mg/kg，是所測(cè)樣品中γ-生育酚含量最高的3種植物油；鮮花椒調(diào)味油、沙棘籽油、小磨香油、稻米油和食用植物調(diào)和油中檢出含量極低的維生素A，平均值不超過(guò)10 mg/kg，除小磨香油外，其余4種植物油中均含有α-生育酚、β-生育酚和γ-生育酚；芝麻油、壓榨亞麻籽油和胡麻油中只檢出γ-生育酚。不同植物油樣品中維生素A和維生素E含量總體分布與吳軻等[24]報(bào)道的結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

本文利用超高效合相色譜法同時(shí)測(cè)定植物油中維生素A、α-生育酚、β-生育酚和γ-生育酚，在5 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)維生素A和不同構(gòu)型維生素E的分離，且β-生育酚和γ-生育酚分離效果良好。該方法檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、穩(wěn)定性良好、前處理操作簡(jiǎn)便快速，可作為植物油中不同脂溶性維生素同時(shí)檢測(cè)的新方法，提高檢測(cè)效率。采用已建立的方法對(duì)不同植物油樣品中的維生素A和維生素E進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，植物油中維生素E的含量最高，其中以α-生育酚和γ-生育酚為主，β-生育酚含量相對(duì)較低，而維生素A只在個(gè)別植物油樣品中檢出，且含量很低。