蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵過程中有效成分的動態(tài)積累變化*

羅巍，劉東波，吳鄭武，夏志蘭，謝紅旗

1(湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙，410128)2(國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術實驗室，湖南長沙，410128)3(湖南省作物種質創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南長沙，410128)

蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵過程中有效成分的動態(tài)積累變化*

羅巍1，2，劉東波1，2，吳鄭武1，2，夏志蘭1，2，謝紅旗1，3

1(湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙，410128)2(國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術實驗室，湖南長沙，410128)3(湖南省作物種質創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南長沙，410128)

通過對蛹蟲草4號菌株進行搖瓶液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，考察了蛹蟲草發(fā)酵過程中發(fā)酵液及菌絲體生物量、蟲草多糖、蟲草酸及蟲草素含量的動態(tài)積累變化情況。結果表明:70%以上的蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素分布在發(fā)酵液中。蛹蟲草菌在第10天生物轉化量達到最大值20.44 mg/mL，蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素含量分別在第11、13、14天達到最大值，綜合考慮3種產(chǎn)物的最佳發(fā)酵周期，將蛹蟲草發(fā)酵時間定為12 d。10 L發(fā)酵罐深層培養(yǎng)試驗的結果表明，生物量達24.5 mg/mL，比搖瓶培養(yǎng)提高19.86%，而蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素含量分別為7.43、2.82、90.73 μg/mL，比搖瓶培養(yǎng)分別提高8.3%、13.7%和15.6%。

蛹蟲草，蟲草多糖，蟲草酸，蟲草素，液態(tài)發(fā)酵

蛹蟲草(Cordycps militarisc Link)又名北冬蟲夏草，屬真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，是冬蟲夏草的近緣種［1］，是我國歷史上十分名貴的珍稀、營養(yǎng)、滋補、保健及藥用真菌［2－3］。尤其近年來研究證明，蛹蟲草所含蟲草活性成分如蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷等含量明顯高于天然冬蟲夏草［4］。并且由于蟲草區(qū)域生態(tài)環(huán)境的脆弱性及人們長期的亂采濫挖，野生蟲草資源早已瀕臨枯竭［5］。積極開展蛹蟲草生物學特性及人工種植技術的研究，具有十分重大的現(xiàn)實意義和顯著的經(jīng)濟價值。

目前，我國蛹蟲草固體栽培技術已得到廣泛應用，并大面積推廣，雖然通過發(fā)酵工程技術進行蛹蟲草菌絲體生產(chǎn)也有了一定的發(fā)展，但國內(nèi)外對蛹蟲草的液態(tài)發(fā)酵研究主要集中在發(fā)酵條件的優(yōu)化及有效成分的檢測方面［6－8］，而對于發(fā)酵過程中有效成分的動態(tài)積累研究甚少，蛹蟲草發(fā)酵培養(yǎng)時間也參差不齊。工業(yè)生產(chǎn)中，一般既要獲得目標產(chǎn)物的最大產(chǎn)量，還要節(jié)省生產(chǎn)成本。因此，研究蛹蟲草發(fā)酵過程中有效成分的動態(tài)積累情況對指導蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 菌種來源、儀器和試劑

1.1.1 供試菌株

蛹蟲草4號菌種由湖南農(nóng)業(yè)大學食用菌研究所提供。

1.1.2 儀器

恒溫水浴鍋(DK-S24型)，上海精宏實驗設備有限公司;超凈工作臺(SW-CJ-2F型)，蘇州凈化設備有限公司;電熱鼓風干燥箱(101-4AB型)，北京中行偉業(yè)儀器有限公司;真空干燥箱，臺式離心機(KA-1000型)，上海安亭科學儀器廠;恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-2102C型)，上海智城分析儀器制造有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50FAS)，上海申安醫(yī)療器械廠;紫外分光光度計(U-3310型)，日本島津公司;高效液相色譜(Prominence UFLC-20A型)，日本島津公司。

1.1.3 試劑

葡萄糖，蔗糖，蛋白胨，KH2PO4，MgSO4，酵母膏，甘露醇，乙醇，高碘酸鈉，醋酸銨，鼠李糖，HCl，高碘酸鈉，苯酚，濃H2SO4，冰醋酸，乙酰丙酮，以上試劑均為分析純，甲醇(色譜純)，蟲草素標準品(Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備斜面菌種

按無菌操作對4號菌株進行轉管接種，在22℃下恒溫培養(yǎng)，直到菌絲長滿斜面培養(yǎng)基(斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基)。

1.2.2 液態(tài)搖瓶發(fā)酵

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基如下:蔗糖2.4%、葡萄糖1.2%、蛋白胨 0.4%、酵母浸出粉 0.2%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.1%。pH 為 6.5～6.8，溫度22℃，轉速130 r/min，搖床黑暗中培養(yǎng)。

每個500 mL三角瓶分裝100 mL液體培養(yǎng)液，滅菌冷卻后將4號菌株的斜面菌種分別接入三角瓶內(nèi)，按上述條件置恒溫振蕩器上培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，從培養(yǎng)的第3天至第21天每天取三角瓶3個，抽濾分離菌絲體和發(fā)酵液后分別進行取樣檢測。

1.2.3 發(fā)酵罐深層發(fā)酵試驗

在搖瓶實驗的基礎上，進行10 L發(fā)酵罐深層培養(yǎng)。發(fā)酵罐發(fā)酵條件為:罐壓 0.05 MPa、攪拌速度130 r/min、空氣流量 210 L/h、培養(yǎng)溫度22℃、添加質量分數(shù)為0.03% 的食用消泡劑(主要成分為單甘脂、磷脂、輕質碳酸鈣等)。培養(yǎng)基配方如1.2.2所述條件，接種菌齡為5 d，接種量10%，發(fā)酵時間12 d。

1.2.4 生物量測定

將培養(yǎng)好的發(fā)酵液，經(jīng)過抽濾得到菌絲體濾餅，50℃真空干燥至恒重，用電子天平稱量。

1.2.5 胞外多糖分析

測量上述收集的濾液體積，加3倍體積的95%乙醇沉淀多糖，置于4℃冰箱中過夜，沉淀多糖用蒸餾水復溶后，采用苯酚-硫酸法測定多糖濃度［9］。

1.2.6 菌絲體胞內(nèi)多糖分析

稱取一定量干燥菌絲體，粉碎，加20倍體積蒸餾水，100℃水浴浸提3 h，高速離心(4000 r/min)10 min，收集上清液，加入3倍體積9 5%乙醇沉淀，置于4℃冰箱過夜，過濾，多糖用蒸餾水復溶，苯酚-硫酸法測定多糖濃度。

1.2.7 蟲草酸含量測定

精密稱取0.5 g菌絲體干粉，置于50 mL三角瓶中，加25 mL蒸餾水，置80℃水浴中，浸提1.0 h，離心，上清液轉入25 mL容量瓶中，殘渣用水洗滌2次，定容。取發(fā)酵液及菌絲體提取液稀釋至所需濃度，按文獻［10］測定蟲草酸含量。

1.2.8 蟲草素檢測

菌絲體加液氮研磨成粉末，稱取粉末0.1 g加入2 mL純凈水，超聲波100 W、60℃處理50 min，4000 r/min離心10 min，取上清液，重復提取3次，合并上清液，過0.45μm濾膜后采用高效液相色譜檢測蟲草素含量，發(fā)酵液直接過0.45 μm濾膜后，進行高效液相色譜檢測。色譜條件［11］:色譜柱:Shim-pack vp-ODS(150mm × 4.6mm，5μm);流動相:V(水)∶V(甲醇)=85∶15，流速 0.8 mL/min;檢測波長 260 nm，進樣量 10 μL，柱溫35 ℃。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草在發(fā)酵過程中生物量的變化情況

本次試驗測量了4號蛹蟲草菌種從第3天至第21天的生長量，蛹蟲草不同發(fā)酵時間生物量的變化情況如圖1所示。從圖1可以看出，生物轉化量從第3～10天處于不斷上升的階段，在第10天達到最大值，在第10～14天，生長量處于穩(wěn)定的，不再上升的階段。從第15天開始菌絲生長量呈下降趨勢，原因可能是菌株在有限的營養(yǎng)濃度內(nèi)，菌絲體達到最大增長限度后，自身開始產(chǎn)生或外溢一些代謝副產(chǎn)物和中間產(chǎn)物，并伴隨著菌絲體自溶現(xiàn)象所致。試驗結果表明，生長量的積累并不是隨著培養(yǎng)時間的增加而不斷上升，而是在某一時間達到一個最大值后不再上升基本保持穩(wěn)定，因此在第10天采收菌絲體較佳。

圖1 蛹蟲草不同發(fā)酵時間的變化曲線

2.2 蟲草多糖的動態(tài)積累變化情況

本實驗檢測了蛹蟲草在第3～21天的發(fā)酵液和菌絲體中蟲草多糖含量，不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液和菌絲體中蟲草多糖含量及產(chǎn)量如圖2所示。由圖2可知，在蛹蟲草發(fā)酵過程中，在第13天發(fā)酵液中蟲草多糖含量達到最大值2.48 mg/mL，然后逐漸減少，至第18天發(fā)酵液中蟲草多糖含量減至0.35 mg/mL，然后基本保持不變。而菌絲體中蟲草多糖含量也第13天達到最大值48.93 mg/g，然后逐漸減少，但是，菌絲體中蟲草多糖與發(fā)酵液比較，其多糖含量減少量較小，在第18d后減少至32.35 mg/g，后也基本保持在這一含量不變。在第6～14 d中，發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量是菌絲體中多糖產(chǎn)量的3倍左右，說明在這期間，蟲草發(fā)酵液中蟲草多糖產(chǎn)量占總量的75%以上。其中發(fā)酵液中多糖含量的隨時間的減少可能是因為隨著整個發(fā)酵液中營養(yǎng)成分的消耗，蟲草菌開始消耗發(fā)酵液中蟲草多糖，以維持其生長，所以發(fā)酵液中蟲草多糖在14～18 d內(nèi)大量的減少。而菌絲體中多糖含量的減少可能是部分多糖轉化為其他產(chǎn)物或供菌絲自身生長。因此，如以生產(chǎn)蟲草多糖為目的的液態(tài)發(fā)酵，最佳培養(yǎng)時間為13天。

圖2 蛹蟲草不同發(fā)酵時間蟲草多糖積累變化曲線

2.3 蟲草酸的動態(tài)積累變化情況

本實驗檢測了蛹蟲草在第3～21天的發(fā)酵液和菌絲體中蟲草酸含量，不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液和菌絲體中蟲草酸含量及產(chǎn)量如圖3所示。由圖3可知，在蛹蟲草發(fā)酵過程中，在第3～10天內(nèi)，發(fā)酵液及菌絲體中，蟲草酸含量急劇增加，直到第11天，兩者中蟲草酸含量都達到最大值6.86 mg/mL和150.08mg/g。從第13～17天，兩者蟲草酸含量都急劇下降，而發(fā)酵液中蟲草酸減少量遠大于菌絲體中蟲草酸減少量。有文獻報道，以甘露醇作為碳源進行蛹蟲草的液態(tài)發(fā)酵，其發(fā)酵效果最佳，生物量最大［12］，蟲草酸即 D-甘露醇，是甘露醇的異構體，因此發(fā)酵液中蟲草酸含量在14～17天內(nèi)，急劇減少，而后基本保持不變，可能由于營養(yǎng)成分的消耗，蟲草菌消耗其代謝產(chǎn)生的蟲草酸，來維持自身生長代謝，甚至消耗體內(nèi)多余蟲草酸以供自身代謝，以至菌絲體中蟲草酸含量也在13～17天內(nèi)劇減。綜上所述，以生產(chǎn)蟲草酸為目的的蛹蟲草液體發(fā)酵，最佳培養(yǎng)時間為11天。

2.4 蟲草素的動態(tài)積累變化情況

本實驗檢測了蛹蟲草在第3～21天的發(fā)酵液和菌絲體中蟲草素含量，不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液和菌絲體中蟲草素含量及產(chǎn)量如圖4所示。由圖4可知:在蛹蟲草液體發(fā)酵過程中，從第4天開始，發(fā)酵中蟲草素產(chǎn)量大于菌絲體中蟲草素產(chǎn)量。第9天后，發(fā)酵液中蟲草素產(chǎn)量是菌絲體中蟲草素產(chǎn)量的2.5倍以上，即這期間，70%以上的蟲草素分泌在發(fā)酵液中。而蟲草素在發(fā)酵液和菌絲體中的積累量都在14天基本達到最大值78.44 μg/mL 和1429.10 μg/g。第14天后，蟲草素產(chǎn)量雖然有略有增加，但是比之14天總產(chǎn)量增加不到1%。所以綜合考慮，以生產(chǎn)蟲草素為目的的液體發(fā)酵，最佳培養(yǎng)時間為14 d。

圖3 蛹蟲草不同發(fā)酵時間蟲草酸積累變化曲線

圖4 蛹蟲草不同發(fā)酵時間蟲草素積累變化曲線

2.5 發(fā)酵罐培養(yǎng)情況

氧是好氧發(fā)酵的限制性基質，所以氧的提供往往就成為產(chǎn)物形成的重要影響因素。早在20世紀50年代，就有學者提出以 KLa為原則進行發(fā)酵工藝放大，并在實踐中取得了較好的結果［13］。在搖瓶實驗的基礎上，綜合考慮蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素產(chǎn)量，12 d是較為合適的發(fā)酵周期，本實驗以 KLa相同原則進行10 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)12d，蛹蟲草10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)情況如表1所示。

表1 蛹蟲草10L發(fā)酵罐培養(yǎng)情況

由表1可知，蛹蟲草在10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中， 菌絲體內(nèi)蟲草酸，蟲草多糖，蟲草素變化規(guī)律基本與搖瓶培養(yǎng)中其物質含量變化規(guī)律一致。但是生物量達24.5 mg/mL，比搖瓶培養(yǎng)提高19.86%，而蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素含量分別為7.43、2.82、90.73 μg/mL，較之搖瓶培養(yǎng)分別提高 8.3%、13.7%、15.6%。

3 結論

(1)本研究通過對蛹蟲草4號菌株的液體發(fā)酵，比較研究了蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素在液體發(fā)酵過程中的動態(tài)積累變化情況，確立了以蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素為生產(chǎn)目的的液體發(fā)酵的最佳發(fā)酵周期分別為11 d、13 d、14 d，以及這3種產(chǎn)物的綜合發(fā)酵周期為12d。 (2)研究表明，蛹蟲草液體發(fā)酵過程中，70%以上的蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素都分布在發(fā)酵液中，而隨著培養(yǎng)時間的延長，在蟲草菌的衰退期，蟲草酸、蟲草多糖出現(xiàn)大幅下降，而蟲草素卻有少量的增加。

(3)蛹蟲草10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得的目的產(chǎn)物較之搖瓶培養(yǎng)都有大幅提高，本研究工作對蛹蟲草深層培養(yǎng)規(guī)模的放大具有一定的理論指導意義。

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Study on the Active Components Accumulation in Cordceps militaris Throngh Femention Process

Luo Wei1，2，Liu Dong-bo1，2，Wu Zheng-wu1，2，Xia Zhi-lan1，2，Xie Hong-qi1，3
1(College of Horticulture and Landscape，HunanAgriculturalUniversity，Changsha 410128，China)2(State Administration of Traditional Chinese Medicine Sub-health Intervention Technology Laboratory Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)3(Key Laboratory for Crop Germplasm Innovation and Utilization of Hunan Province，Changsha 410128，China)

The dynamic variation of the accumulation of biomass，Cordyceps polysaccharides，cordycepic acid and cordycepin were compared through fermentation process.The results showed that 70%of Cordyceps polysaccharide，Cordyceps acid and cordycepin was distributed in the fermentation broth.The optimum fermentation period was 12d by considering these three products.The results of 10 L fermentation tank submerged culture test showed that the biomass reached 24.5 mg/mL，which increased 19.86%compared with shaking flask culture，while the Cordyceps acid，CP，cordycepin content were 7.43 mg/mL，2.82 mg/mL，90.73 μg/mL respectively，which increased 8.3%，13.7%and 15.6%compared with shaking flask culture.

Cordyceps militaris，cordycepic acid，cordycepin，Cordyceps polysaccharide

碩士研究生(謝紅旗副教授為通訊作者)。

*湖南農(nóng)業(yè)大學人才基金(08YJ15);湖南省教育廳科學研究項目(09C499);作物種質創(chuàng)新與資源利用重點實驗室科學基金開放項目(10kfxm11)

2011－04－13，改回日期:2011－05－24