乳酸菌表層蛋白的分離及其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)*

朱曉，胡斌，李景艷，劉慧博，盧蓉蓉

(江南大學食品學院，江蘇無錫，214122)

乳酸菌表層蛋白的分離及其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)*

朱曉，胡斌，李景艷，劉慧博，盧蓉蓉

(江南大學食品學院，江蘇無錫，214122)

對自主擁有的多株乳酸菌進行了表層蛋白的分離和鑒定，并對其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行了研究。采用LiCl溶液進行提取，經(jīng)SDS-PAGE檢測，確定嗜酸乳桿菌fb116、嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213攜帶表層蛋白。采用差示掃描量熱儀(DSC)測定，其變性溫度分別為63.67℃，61.98℃和59.78℃。它們的氨基酸組成大致相同，疏水氨基酸含量高達45%，酸性氨基酸含量在21%左右，遠高于堿性氨基酸。圓二色譜法(CD)分析顯示，其二級結(jié)構(gòu)相似，α-螺旋和β-折疊約占34%和12%。去除表層蛋白之后，3株菌株的自動聚集能力和表面疏水性出現(xiàn)下降，這提示表層蛋白的存在有助于乳酸菌黏附性能的發(fā)揮。

乳酸菌，表層蛋白，二級結(jié)構(gòu)，表面性質(zhì)，氨基酸組成

大多數(shù)細菌細胞壁的表面存在次晶格陣列結(jié)構(gòu)，透明、勻稱、高度多孔且孔徑均一。這層表面結(jié)構(gòu)以非共價鍵與細胞壁結(jié)合，通常能用促溶劑鹽酸胍和離解劑LiCl溶液溶解成蛋白單體——表層蛋白(surface layer proteins)，其分子質(zhì)量為40～200 ku。在細菌細胞總蛋白中，表層蛋白的含量高達10% ～15%。除去提取劑后，表層蛋白本能地重新組裝成次晶格陣列結(jié)構(gòu)。目前認為，表層蛋白具有保護和決定細胞形態(tài)、分子、離子肼和胞外酶的結(jié)合位點、細胞黏附和表面識別以及作為病原菌的毒力因子等功能［1］。

乳酸菌表層蛋白分子質(zhì)量僅為25～71 ku，是分子質(zhì)量最小的一類表層蛋白，其等電點 pI為9.4～10.4，這是它們區(qū)別于其他表層蛋白的典型特征。表層蛋白具有多樣性，目前，只有少數(shù)表層蛋白的氨基酸序列是已知的［2-4］，對其功能了解也較少。有些乳酸菌的表層蛋白對其表面性質(zhì)有一定影響，并與它們黏附腸上皮細胞和細胞外基質(zhì)有關(guān)［5-10］。

在發(fā)酵食品(如泡菜、豆豉和酸乳)中存在著多種乳酸菌。乳酸菌是公認的益生菌，近幾年在食品工業(yè)上得到了高度關(guān)注。由于乳酸菌和表層蛋白具有多樣性和差異性，本文旨在從自主擁有的乳酸菌資源平臺中發(fā)掘攜帶表層蛋白的乳酸菌，研究這些表層蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，探討它們在乳酸菌益生性質(zhì)中發(fā)揮的作用機制，為這些乳酸菌的實踐應(yīng)用提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 菌種

嗜酸乳桿菌fb115(Lactobacillus acidophilus fb115)、嗜酸乳桿菌 fb116(Lactobacillus acidophilus fb116)、瑞士乳桿菌 fb213(Lactobacillus helveticus fb213)、干酪乳桿菌 fb34(Lactobacillus casei fb34)、植物乳桿菌N34(Plant lactobacillus N34)、植物乳桿菌N29(Plant lactobacillus N29)、兩歧雙歧桿菌fb35(Bifidobacterium bifidum fb35)、鼠李糖乳桿菌 fb36(Lactobacillus rhamnosus fb36)，由江南大學食品學院食品生物技術(shù)研究中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖40 g/L，乙酸鈉10 g/L，無水MgSO40.048 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，檸檬酸氫二銨 2 g/L，KH2PO4·3H2O 2.68 g/L，吐溫 80 2.0 mL/L，pH 6.2 ～6.4;MRS 固體培養(yǎng)基:在 MRS 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂粉15 g/L。

1.3 試劑

SDS-PAGE低分子質(zhì)量標準蛋白Marker(14.4～97.4 ku)，中科院上海生物化學研究院;牛血清清蛋白，上海華美生物工程公司;0.22 μm混合纖維素濾膜，上海興亞凈化材料廠;透析袋，截留分子質(zhì)量14 ku，上海綠鳥科技有限公司;其它試劑均為分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

Minispin plus高速離心機，德國EPPENDORF公司;Avanti J-26 XP高速冷凍離心機，BECKMAN COULTER公司;DKY-II恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床，上海杜科自動化設(shè)備有限公司;GRP 9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司;DYY-IIB三恒電泳儀，北京市六一儀器廠;GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-rad伯樂公司;UV-1100

紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司;6 L落地式凍干機，美國LABCONCO公司;DSC-7差示掃描量熱儀，Perkin Elmer公司;SYNAPT MS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國WATERS公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 菌株的活化和傳代

將已活化的乳酸菌轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為20 mL/L。于37℃恒溫培養(yǎng)18 h至對數(shù)末期，傳接3代，留取第3代的菌液。離心(5 000 r/min，4 ℃，15 min)收集菌體，用0.01 mol/L 無菌的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.2)重懸洗滌2次，制備菌懸液備用。

1.5.2 菌體全蛋白和表層蛋白的提取

參考Garrote等［11］的方法并作適當改動。離心(5 000 r/min，4 ℃，15 min)收集菌體，加入1/10 體積的10 g/L SDS溶液，混勻，煮沸10 min。離心(12 000 r/min，4℃，15 min)收集上清液，得到菌體全蛋白提取液，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

提取表層蛋白時，收集菌體后，用1/10體積的5 mol/L LiCl溶液，在37℃、180 r/min的搖床中處理60 min，再進行離心。其他處理方式同上。取部分上清液于透析袋中，每2 h換水1次至完全透析。凍干。凍干物保存于-20℃，備用。

1.5.3 SDS-PAGE 電泳分析

分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，起始電壓80 V，溴酚藍前緣進入分離膠后150 V，進行蛋白質(zhì)考馬斯亮藍R-250染色。鑒定實驗菌株是否攜帶表層蛋白。

1.5.4 表層蛋白的變性溫度分析

采用差示掃描量熱儀(DSC)進行分析［12］。稱取2～4 mg蛋白質(zhì)凍干物于鋁盒中壓片，記錄樣品質(zhì)量。設(shè)定溫度區(qū)間為30～130℃，升溫速率為10℃/min。

1.5.5 表層蛋白的氨基酸組成分析

采用酸水解法，利用液相串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)測定除色氨酸以外的氨基酸含量。

1.5.6 表層蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

采用圓二色譜法。樣品濃度:0.01～0.2 g/L，掃描波長范圍:190～250 nm，掃描速率:100 nm/min，光程:l mm。掃描平行3次。

1.5.7 菌株自動聚集能力分析

參考Chen等人［13］的方法，并作適當改動。調(diào)整菌懸液濃度至約108CFU/mL。取2 mL上層菌懸液，混勻15 s，室溫下放置4 h后測定600 nm吸光度。自動聚集能力百分比計算公式:

式中:A0表示最初菌懸液在600 nm的吸光度;A4表示4 h時菌懸液在600 nm的吸光度。

1.5.8 表面疏水性分析

參考Kos等人［8］的方法，并做適當修改。調(diào)整菌懸液濃度至約108CFU/mL，測定其在600 nm下的吸光度，記為A0。取3 mL調(diào)整濃度后的菌液，加入1 mL二甲苯，振蕩5 min，靜置30 min，等待分層。取水相，在600 nm下測定A1。細菌細胞表面疏水性計算公式:

式中:A0表示最初菌懸液在600 nm的吸光度;A1表示分層后水相菌懸液在600 nm的吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

文中數(shù)據(jù)為3次平行測定值的平均值。顯著性分析采用SPSS 16.0○R(美國 SPSS公司)的單因素方差分析(One-Way ANOVA，Turkey)在顯著性水平P=0.05下進行數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計。

2 結(jié)果和討論

2.1 攜帶表層蛋白的乳酸菌的初篩

根據(jù)報道，嗜酸乳桿菌表層蛋白分子質(zhì)量在41～49 ku［1，14-15］，瑞士乳桿菌表層蛋白分子質(zhì)量在 43 ～52 ku［9，16-17］左右。由圖 1 和圖 2 可以看出，分子質(zhì)量40～70 ku內(nèi)，只有嗜酸乳桿菌fb115、嗜酸乳桿菌fb116以及瑞士乳桿菌fb213的LiCl提取物和SDS提取物在45～66 ku內(nèi)有主要的蛋白條帶，均大于45 ku，可判斷這3株乳桿菌攜帶表層蛋白。

2.2 表層蛋白的熱變性溫度

嗜酸乳桿菌fb116、嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213的表層蛋白凍干物的DSC分析圖譜分別見圖3，這3種表層蛋白的變性溫度 Tm分別為(63.67 ±0.28) ℃，(61.98 ± 0.67) ℃ 和(59.78 ±0.85) ℃。

圖3所示，3株乳桿菌表層蛋白的DSC曲線均只出現(xiàn)了1個吸熱峰，峰形較為對稱。相比有些乳酸菌的表層蛋白有2個變性溫度，一個在57～70℃，一個在98～118℃［12］，3株乳桿菌的表層蛋白的熱變性溫度比文獻報道值略低，這與表層蛋白的二級結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量、輕重鏈長度比例以及氨基酸組成等因素有關(guān)。這進一步驗證了不同菌株之間表層蛋白的差異性。

圖1 LiCl提取表層蛋白和SDS提取細胞全蛋白的SDS-PAGE圖譜

圖2 LiCl提取表層蛋白和SDS提取細胞全蛋白的SDS-PAGE圖譜

圖3 3株乳酸菌表層蛋白的DSC熱變性圖譜

表1 3株乳酸菌表層蛋白的氨基酸組成 %

2.3 表層蛋白的氨基酸組成

蛋白質(zhì)的氨基酸組成影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)以及功能。3株乳酸菌的表層蛋白凍干物的氨基酸組成結(jié)果分別如表1所示。

由表1可知，3株乳酸菌的表層蛋白的氨基酸組成大致相近:帶羥基氨基酸含量達15%左右;疏水氨基酸含量高達45%左右，稍高于表層蛋白的平均水平［1］;酸性氨基酸含量在21%左右，遠高于堿性氨基酸;堿性氨基酸中賴氨酸含量最高，達8% ～10%;組氨酸、精氨酸和蛋氨酸含量也較低，半胱氨酸幾乎沒有。高含量的酸性氨基酸使乳酸菌表層蛋白的等電點pI偏堿性。此外，含硫氨基酸含量很低，推測這3種表層蛋白的二硫鍵很少，維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力則主要為非共價鍵。

2.4 表層蛋白的二級結(jié)構(gòu)

表2顯示，3株乳酸菌的表層蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成具有高度的相似性;均表現(xiàn)為α-螺旋和無規(guī)則卷曲的含量較高，α-折疊和 β-轉(zhuǎn)角所占的比例較低。據(jù)文獻報道［1］，乳酸菌表層蛋白平均大約有20%的氨基酸形成了α-螺旋，40%形成β-折疊，而形成的無規(guī)卷曲和α-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)則在5% ～45%之間變化。3株實驗菌株的表層蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的β-折疊的含量較文獻報道［1，12］的偏低，而 α-螺旋含量較文獻報道［1，12］要高出很多，這種二級結(jié)構(gòu)的比例組成恰能說明3株乳酸菌的熱變性溫度比文獻報道的偏低，低含量的β-折疊使蛋白質(zhì)更容易在較低的溫度下熱變性。

此外，α-螺旋、β-折疊的比例與氨基酸組成有關(guān)。通常，高含量的谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸有利于α-螺旋的形成，而纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸則有利于形成β-折疊。以瑞士乳桿菌fb213的表層蛋白為例，谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸含量之和為21.77%，高于纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸的含量之和17.52%，這可以部分解釋其α-螺旋多于β-折疊的現(xiàn)象。另外兩種表層蛋白也類似。

表2 3株乳桿菌的表層蛋白的二級結(jié)構(gòu)

2.5 表層蛋白對菌株表面性質(zhì)的影響

乳酸菌表面性質(zhì)中的表面疏水性和自動聚集能力通常被認為是兩個獨立、能夠反映菌株黏附能力的特征。

2.5.1 表層蛋白對菌株自動聚集的影響

自動聚集是微生物之間的相互作用，對于一些益生菌來說，自動聚集是黏附腸上皮細胞或與病原菌共聚集形成保護屏障而阻止病原菌的第一步［18］，測定去除表層蛋白前后菌株自動聚集能力的變化可驗證它們是否參與了這一過程［19］。如表3所示，經(jīng)過5 mol/L的LiCl溶液處理之后，破壞了菌體的表層，去除了大量表層蛋白之后，3株實驗菌株的自動聚集能力大約下降了12% ～23%。這表明，表層蛋白或完整的表層參與了菌體細胞的自動聚集過程，進而可能參與了菌體細胞的對腸上皮細胞的黏附，使得菌株得

以定植于腸道，抑制病原菌的黏附。

2.5.2 表層蛋白對菌株表面疏水性的影響

嗜酸乳桿菌fb116、嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213經(jīng)LiCl處理、去除表層蛋白前后，菌株的表面疏水性變化見表3。嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213在去除表層蛋白之后，其表面疏水性顯著下降，表明它們的表層蛋白對菌株的表面疏水性有所貢獻。疏水性的強弱主要取決于細菌表面非極性基團的多少，與脂磷壁酸等結(jié)構(gòu)也有關(guān)。嗜酸乳桿菌fb116在去除表層蛋白之后，其表面疏水性反而升高，可能因為除去表層蛋白后裸露的細胞壁表面疏水性更強。這也體現(xiàn)了表層蛋白的菌株特異性。表層蛋白影響了菌株的表面疏水性，后者與菌株的黏附能力相關(guān)［20］。初步推斷，嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213的表層蛋白可能影響菌株的黏附性質(zhì)。

表3 菌株的表面性質(zhì)分析

3 結(jié)論

從自主擁有的乳酸菌資源平臺中篩選了3株攜帶表層蛋白的乳桿菌，分別為嗜酸乳桿菌fb116、嗜酸乳桿菌fb115和瑞士乳桿菌fb213。3種表層蛋白的變性溫度分別為 63.67，61.98，59.78 ℃。它們的氨基酸組成大致相同，二級結(jié)構(gòu)也具有高度的相似性，α-螺旋和β-折疊約占34%和12%，無規(guī)則卷曲約占33%，結(jié)構(gòu)較為松散，導致變性溫度較低。鑒于菌株的表面性質(zhì)與黏附性質(zhì)的強相關(guān)性，初步推測，這3株乳酸菌的表層蛋白可能與其黏附性質(zhì)也有關(guān)，利于菌株益生功能的發(fā)揮。

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Surface Layer Proteins of Lactobacillus:Isolation，Structure and Properties

Zhu Xiao，Hu Bin，Li Jing-yan，Liu Hui-bo，Lu Rong-rong
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

In the present study several lactobacillus carrying surface layer proteins had been screened from those owned by our laboratory.They were Lactobacillus acidophilus fb116，Lactobacillus acidophilus fb115 and Lactobacillus helveticus fb213.The thermal analysis of the lyophilized surface layer proteins were performed by differential scanning calorimetry(DSC).DSC analysis showed one phase transition with maxima located at ca.63.67℃，61.98 ℃and 59.78 ℃ for these three proteins.The amino acid compositions of the three proteins were determined mostly the same，which had a high content(45%)of hydrophobic amino acids and a higher content(24%)of acidic amino acids then basic ones.By circular dichrosim(CD)spectra the secondary structures of the proteins were predicted to be composed similarly of 34%alpha-helix and 12%beta-sheet.After removal of surface layer proteins，the autoaggregation percentage and the cell surface hydrophobicity of the three lactobacillus were reduced.It was implied that the surface layer proteins played a role in adhesion property of Lactobacillus.

Lactobacillus，surface layer proteins，secondary structure，surface properties，amino acid composition

碩士(盧蓉蓉教授為通訊作者，E-mail:lurr@jiangnan.edu.cn)。

*教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃(NCET-09-0436);國家自然科學基金(No.31071491)

2011-07-26，改回日期:2011-08-07