“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝的探討
——硫化物對(duì)木薯酒精發(fā)酵的影響*

姜立，張成明，張宏健，毛忠貴

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 ，214122)

“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝的探討
——硫化物對(duì)木薯酒精發(fā)酵的影響*

姜立1，2，張成明1，2，張宏健1，2，毛忠貴1，2

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 ，214122)

木薯酒精發(fā)酵時(shí)，采用“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝會(huì)積累SO42－及其還原產(chǎn)物，對(duì)“雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝的順利進(jìn)行不利，為解決該問(wèn)題，研究了硫酸鹽、亞硫酸鹽以及S2－對(duì)木薯酒精高濃發(fā)酵(料水比1∶2.2)的影響，結(jié)果表明，SO42－對(duì)木薯酒精發(fā)酵基本沒(méi)有影響，而SO32－和S2－對(duì)木薯酒精發(fā)酵影響顯著。在實(shí)驗(yàn)所添加的SO32－和S2－濃度范圍內(nèi)，隨著硫化物濃度的增加，酒精產(chǎn)量逐漸降低，而副產(chǎn)物甘油產(chǎn)量逐漸升高;并且S2－的加入使發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)S2－濃度為6.0 mmol/L時(shí)，發(fā)酵時(shí)間延遲48 h。后兩者均對(duì)乙醇發(fā)酵不利，應(yīng)在雙循環(huán)耦聯(lián)工藝中去除。

硫酸鹽，亞硫酸鹽，S2－，木薯，酒精發(fā)酵，無(wú)廢制造

以木薯生產(chǎn)燃料酒精，由于原料的非糧特性，近年來(lái)得到了較快發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)的生產(chǎn)規(guī)模已接近200萬(wàn)t/年。然而，燃料酒精蒸餾廢水污染問(wèn)題始終是制約其可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。通常的厭氧好氧法處理，經(jīng)濟(jì)上難以承受。蒸餾廢液回用技術(shù)雖然取得了一定進(jìn)展，但由于需要進(jìn)行固液分離，且廢液中又含有少量泥沙，造成分離裝備的高維護(hù)成本，另外需對(duì)低pH的廢液加堿調(diào)節(jié)，既增加了成本，又產(chǎn)生大量可溶性離子，對(duì)工藝長(zhǎng)期運(yùn)行不利。同時(shí)廢液中酒精酵母發(fā)酵的副產(chǎn)物，如小分子有機(jī)酸、異戍醇、甘油等隨著廢液回用進(jìn)入下一批發(fā)酵液，對(duì)酒精酵母的生長(zhǎng)或發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用［1］，使得蒸餾廢液只能少量(25%左右)回用。

為解決困擾燃料酒精的廢水污染問(wèn)題，在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)及長(zhǎng)期探索的基礎(chǔ)上［2－5］，本實(shí)驗(yàn)室提出了“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝(圖1)。

圖1 “酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝

該工藝借鑒生態(tài)系統(tǒng)中生物鏈的物質(zhì)代謝關(guān)系，將酒精發(fā)酵階段產(chǎn)生的蒸餾廢液直接經(jīng)過(guò)高溫－中溫兩階段厭氧處理，在降解纖維素半纖維素以及酵母代謝副產(chǎn)物的同時(shí)，產(chǎn)生沼氣，實(shí)現(xiàn)全工藝零污染零能耗［6－9］。

該循環(huán)工藝中，由于厭氧出水pH一般在7.6～8.2中性略偏堿，酒精發(fā)酵工藝中需要添加H2SO4調(diào)節(jié)糖化和發(fā)酵pH到4.2～4.5，滿足糖化酶的最佳作用pH，同時(shí)抑制雜菌生長(zhǎng)(即所謂的“以酸制酸”技術(shù))。但沼液中溶解了大量的CO2形成HCO3－緩沖體系，這種緩沖體系能保護(hù)厭氧反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定而避免其酸化，卻使得沼液作為工藝配料水調(diào)節(jié)pH時(shí)引入過(guò)量SO42－。SO42－在沼氣發(fā)酵的還原態(tài)環(huán)境中被硫酸鹽還原菌(SRB)逐步還原成SO2、H2S及其它中間價(jià)態(tài)硫化物，它們會(huì)對(duì)整個(gè)沼氣發(fā)酵的微生物體系造成毒害作用，危害整個(gè)沼氣部分的穩(wěn)定性［10］，但是它們對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)以及乙醇發(fā)酵的作用還不明了。由于一般工藝條件下，硫化物在燃料酒精生產(chǎn)過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生，因而未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。但是在“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝中會(huì)出現(xiàn)，因而有必要深入研究這些硫化物對(duì)木薯酒精發(fā)酵的影響。文中通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析了3種硫化物:SO42－、SO32－、S2－對(duì)木薯高濃酒精發(fā)酵的影響，以期完善“酒精沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)”循環(huán)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯:河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

菌種:安琪耐高溫活性釀酒干酵母。

液體耐高溫α－淀粉酶(20 000 U/mL)、液體糖化酶(130 000 U/mL)，無(wú)錫杰能科生物工程有限公司產(chǎn)品;其它試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純的商品試劑。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06 ，pH 自然，0.08 MPa滅菌15 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

接1環(huán)生長(zhǎng)良好的斜面酵母至200 mL種子培養(yǎng)基中，28℃，100 r/min培養(yǎng)18 h。

1.2.2 液化

將木薯粉碎，過(guò)40目篩，稱取適量，用蒸餾水調(diào)漿，拌勻后用2%H2SO4溶液調(diào)pH到6.0～6.4。按10 U/g木薯粉加入耐高溫α－淀粉酶，于沸水浴中液化1 h。

1.2.3 同步糖化發(fā)酵

將1.2.2中得到的液化液冷卻至60℃，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%H2SO4調(diào)節(jié)料液pH至所需pH值，并按實(shí)驗(yàn)所需添加一定量的糖化酶，待料液冷卻至30℃，接入10%酵母種子液，0.1% 尿素，于30℃ 恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵。

1.3 分析方法

糖化酶活力測(cè)定:按GB8276－1987測(cè)定。

酒精含量的測(cè)定:蒸餾法［11］、HPLC 法。

還原糖測(cè)定:斐林試劑法［11］。

總糖測(cè)定:樣品用2%HCl于沸水浴中水解2 h，中和后按還原糖測(cè)定方法測(cè)定。

酵母數(shù)量的測(cè)定:血球計(jì)數(shù)法［12］。

甘油、葡萄糖含量的測(cè)定:高效液相色譜，色譜條件為:美國(guó)Dionex UltiMate 3000 HPLC，示差折光檢測(cè)器日本 Shodex RI－101，紫外檢測(cè)器 Dionex Ulti-Mate 3000，分析柱 Bio－Rad HPX－87 H離子交換柱，柱溫60℃，流動(dòng)相0.005 mmol/L稀 H2SO4，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 SO42－對(duì)木薯酒精發(fā)酵的影響

按照木薯粉與蒸餾水為1∶2.2的配比，液化調(diào)漿，分裝。設(shè)定 Na2SO4加入濃度梯度為:0、7、14、21、28、35 mmol/L，該濃度是根據(jù)厭氧消化液回用時(shí)添加的H2SO4濃度來(lái)確定的。每個(gè)梯度取3個(gè)平行，進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中失重的變化如圖2，其它各項(xiàng)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖2 濃度對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程中失重的影響

表1 濃度對(duì)酒精發(fā)酵性能的影響

表1 濃度對(duì)酒精發(fā)酵性能的影響

0 14.68 9.67 0.57 1.62 3.32 7 14.71 9.72 0.55 1.58 3.28 14 14.65 9.53 0.52 1.70 3.35 21 14.70 9.57 0.60 1.68 3.18 28 14.69 9.59 0.58 1.59 3.65 35 14.67 9.54 0.56 1.67 3.48

按照木薯粉與蒸餾水為1∶2.2的配比，液化調(diào)漿，分裝，加入濃度梯度為:0、6、12、18、24、30 mmol/L的Na2SO3，該梯度由實(shí)驗(yàn)改進(jìn)而來(lái)，每個(gè)梯度取3個(gè)平行，進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中失重的變化如圖3所示，其它各項(xiàng)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖3 c［SO32－］對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程中失重的影響

表2 c［SO32－］對(duì)酒精發(fā)酵性能的影響

如圖3所示，cSO32－濃度越大，木薯發(fā)酵培養(yǎng)基失重變化越快，與表2中酒精產(chǎn)量呈現(xiàn)相反的變化。這是由于在酵母發(fā)酵過(guò)程中，整個(gè)培養(yǎng)基體系的pH迅速下降到4.0左右，使反應(yīng)向右移動(dòng)，放出SO2氣體。Na2SO3濃度越高，產(chǎn)生SO2氣體越多，使得發(fā)酵體系失重表現(xiàn)出了與酒精產(chǎn)量不一致的現(xiàn)象。由對(duì)照和添加了亞硫酸溶液的樣品之間的對(duì)比，可知添加Na2SO3對(duì)整個(gè)發(fā)酵體系產(chǎn)生了抑制作用。

如表2所示，SO32－越多，發(fā)酵結(jié)束乙醇濃度越低，甘油產(chǎn)量越多，殘還原糖、殘總糖濃度逐漸上升，酵母數(shù)呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)。甘油產(chǎn)量升高與酵母細(xì)胞自我保護(hù)密切相關(guān)［13－14］，SO32－導(dǎo)致酵母細(xì)胞生存條件惡化，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了更多的甘油維持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定。并且由于SO2氣體這種殺菌劑的產(chǎn)生，對(duì)酵母的生長(zhǎng)代謝也起到了一定的抑制作用，當(dāng)SO32－濃度為30mmol/L時(shí)，甘油產(chǎn)量高達(dá) 15.13 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)下降到了13.26%。

由圖4電鏡照片可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件下添加的亞硫酸鹽對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)幾乎沒(méi)有影響，酵母形態(tài)完整正常。故可以認(rèn)為對(duì)酒精發(fā)酵的影響主要表現(xiàn)在代謝產(chǎn)生了更多的副產(chǎn)物甘油，使得最終酒精產(chǎn)量下降。

圖4 發(fā)酵36 h酵母細(xì)胞電鏡照片

綜合上述結(jié)論可知，發(fā)酵體系中的SO32－對(duì)木薯酒精發(fā)酵是不利的，可以通過(guò)對(duì)厭氧沼液通入一定量的空氣，使之完全氧化去除，消除其對(duì)發(fā)酵的不利影響。

2.3 S2－對(duì)高濃度木薯酒精發(fā)酵的影響

按照木薯粉與蒸餾水為1∶2.2的配比，液化調(diào)漿，分裝，加入濃度梯度為:0、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 mmol/L的Na2S(濃度梯度為實(shí)驗(yàn)改進(jìn)而來(lái))，每個(gè)梯度取3個(gè)平行，進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中失重的變化如圖5，其它各項(xiàng)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

圖5 cS2－對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程中失重的影響

表3 cS2－對(duì)酒精發(fā)酵性能的影響

如圖5所示，S2－的添加濃度越大，對(duì)木薯高濃酒精發(fā)酵過(guò)程的抑制作用越明顯，具體表現(xiàn)在對(duì)發(fā)酵的延遲上，當(dāng)Na2S的濃度為6.0 mmol/L時(shí)，發(fā)酵體系的延遲期達(dá)到了48 h。但是當(dāng)發(fā)酵啟動(dòng)后，幾乎所有添加Na2S的組都能夠在60 h內(nèi)結(jié)束發(fā)酵，由此推知，Na2S對(duì)整個(gè)酒精發(fā)酵體系的影響主要來(lái)自對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制上，對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程沒(méi)有影響，同時(shí)發(fā)酵過(guò)程中不斷有濃重的臭雞蛋味道放出，可以推知，隨著發(fā)酵液pH的下降，在酸性條件下發(fā)生反應(yīng):

H2S是公認(rèn)的毒性氣體，它的存在嚴(yán)重影響了酵母的生長(zhǎng)，隨著H2S濃度的增大，酵母在發(fā)酵的過(guò)程中產(chǎn)生了更多的甘油來(lái)抵御毒害。

如表3所示，隨著Na2S添加濃度的增大，發(fā)酵培養(yǎng)基中的最終甘油產(chǎn)量逐漸增加，酒精產(chǎn)量逐漸減少，殘總糖含量逐漸增大。當(dāng)S2－的濃度為6 mmol/L時(shí)影響最為顯著，發(fā)酵時(shí)間延遲到了48 h，發(fā)酵結(jié)束最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為13.20%，比對(duì)照(14.68%)低了10% ，甘油產(chǎn)量為15.00 g/L比對(duì)照(9.67g/L)高了55.12%。

由圖6電鏡照片可以看出，當(dāng)Na2S的添加濃度較低(2.4 mmol/L)時(shí)，酵母細(xì)胞的形態(tài)都非常完整，并沒(méi)有發(fā)生變化或是破裂，所以能夠在較短的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)并且正常發(fā)酵。當(dāng)Na2S的添加濃度較大時(shí)(6.0 mmol/L)，發(fā)酵36 h部分酵母細(xì)胞破裂，極少酵母細(xì)胞出芽生殖。后期可能是由于H2S氣體的大量釋放，使得體系中的S2－濃度下降，少數(shù)存活的酵母細(xì)胞繼續(xù)繁殖，使得發(fā)酵能夠維持。如果Na2S濃度繼續(xù)增大，那么可能將維持酵母細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)的活力完全消除，發(fā)酵將會(huì)被完全抑制。

圖6 發(fā)酵36 h酵母細(xì)胞電鏡照片

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，S2－的存在對(duì)乙醇發(fā)酵的抑制和毒害作用非常明顯，主要表現(xiàn)在對(duì)酵母的傷害上。必須在發(fā)酵之前去除，可以考慮在“資源化”過(guò)程中加入少量的過(guò)氧化氫去除，否則不利于乙醇發(fā)酵的順利進(jìn)行。

3 討論

不同的硫化物對(duì)木薯酒精發(fā)酵(料水比1∶2.2)的影響有明顯差異。S對(duì)木薯酒精發(fā)酵幾乎沒(méi)有影響，對(duì)酒精發(fā)酵有一定的影響，當(dāng)濃度為30 mmol/L時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)僅為 13.26%，甘油產(chǎn)量高達(dá)15.13 g/L。S2－對(duì)酒精發(fā)酵的影響非常顯著，當(dāng)?shù)臐舛葹? mmol/L時(shí)，發(fā)酵時(shí)間延遲到了48 h。

SO2和H2S及其他中間價(jià)態(tài)硫化物會(huì)危害到整個(gè)產(chǎn)沼氣體系的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)證明硫酸鹽還原產(chǎn)物SO32－及S2－會(huì)影響酒精發(fā)酵，不利于木薯乙醇發(fā)酵，因此在整個(gè)循環(huán)工藝中應(yīng)盡量消除。文中提到的消除這2種對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生不利影響的硫化物的方法僅作為一種暫時(shí)的處理手段。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)不斷改進(jìn)“資源化”手段，使“酒精沼液雙發(fā)酵耦聯(lián)”工藝能夠得到更好的應(yīng)用。

［1］ Moon，Nancy J.Inhibition of the growth of acid tolerant yeasts by acetate，lactate and propionate and their synergistic mixtures［J］.Journal of Applied Bacteriology，1983，55:453－460.

［2］ Wojciech Bialas，Daria Szymanowska，Wlodzimierz Grajek.Fuel ethanol production from granular corn starch using Saccharomyces cerevisiae in a long term repeated SSF process with full stillage recycling［J］.Bioresource Technology，2010，101(9):3 126 －3 131.

［3］ 趙江，趙華.酒糟濾液全回用技術(shù)在酒精發(fā)酵上的應(yīng)用［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29(06):75 －78.

［4］ Ding Zhong－ yang，Zhang Ling，F(xiàn)ang Ya－ ye ，et al.Application of full permeate recycling to very high gravity ethanol fermentation from corn［J］.Korean J Chem Eng，2009，26(3):719 －723.

［5］ 毛忠貴，張建華.燃料乙醇制造的“零能耗零污染”趨勢(shì)［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2008，24(6):946 －949.

［6］ 張靜，翟芳芳，張建華，等.酒精沼氣雙發(fā)酵偶聯(lián)中厭氧沼氣的發(fā)酵行為［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29(2):276－281.

［7］ Zhang Cheng－ming，Mao Zhong－gui.Effective ethanol production by reutilizing waste distillage anaerobic digestion effluent in an integrated fermentation process coupled with both ethanol an methane fermentation［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2010，33(9):1067 －1075.

［8］ Sun Fu－bao，Mao Zhong－gui，Tang Lei，et al.Explo-ration of water－recycled cassava bioethanol production integrated with anaerobic digestion treatment［J］.African Joumal of Biotechnology，2010，9(37):6 182－6 190.

［9］ Sun Fu－bao，Mao Zhong－gui，Zhang Jian－h(huán)ua，et al.Water － recycled Cassava Bioethanol Production Integrated with Two － stage UASB Treatment［J］.Chinese Journal of Chemical Engineering，2010，18(5):837－842.

［10］ 鄭新，閔航.亞硫酸鹽、硫化物對(duì)厭氧消化的影響［J］.環(huán)境污染與防治，1995，17(4):1 －4.

［11］ 蔡定域，釀酒工業(yè)分析手冊(cè)［M］.北京:輕工業(yè)出版社，1988:50－64.

［12］ 諸葛健，王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1994，220－223.

［13］ Carine Bideaux ，Sandrine Alfenore，Xavier Cameleyre，et al，Minimization of Glycerol Production during the High-Performance Fed-Batch Ethanolic Fermentation Process in Saccharomyces cerevisiae，using a Metabolic Model as a Prediction［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72(3):21 －34.

［14］ 黨衛(wèi)紅.亞硫酸鹽的毒性作用［J］ .河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，19(4):318 －320.

The Improvement of Ethanol － methane Coupled Process—The Effect of Sulfides on Ethanol Fermentation in Cassava mashes

Jiang li1，2，Zhang Cheng-ming1，2，Zhang Hong-jian1，2，Mao Zhong-gui1，2
1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)2(School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The sulphate and its reduction products could be accumulated in Dual Coupling of Ethanol and Methane Fermentation Process which do harm to the whole process.The effect of three sulfides including sulphate sulfite and sulfion on ethanol fermentation of very high gravity cassava mashes(the ratio of cassava and water to 1∶2.2(w/w)was researched in this article.The final results showed that sulfite and sulfion had great influence on ethanol fermentation，but sulphate had not.With the sulfite and sulfion concentration increased under the experiments concentration，the yield of ethanol decreased and the byprocuct glycerol increased.The lag phase delayed when the fermentation mashes added with sulfion .It delayed to 48h when the sulfion concentration was 6.0 mmol/L.Both of the two sulfides that harmed ethanol fermentation needed to be eliminated during the dual coupling fermentation.

sulphate，sulfite，sulfion，cassava，ethanol fermentation，cleaner production

碩士(毛忠貴教授為通訊作者)。

*“十一五”國(guó)家863計(jì)劃導(dǎo)向項(xiàng)目(2008AA10Z338)

2011－04－21，改回日期:2011－06－23