甘薯葉總黃酮含量的測(cè)定*

李光，余霜，鄧銀，陳慶富

1(安順學(xué)院化學(xué)與生物農(nóng)學(xué)系，貴州安順，561000) 2(安順學(xué)院資源管理與環(huán)境科學(xué)系，貴州安順，561000)3(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)，550001)

甘薯葉總黃酮含量的測(cè)定*

李光1，3，余霜2，3，鄧銀3，陳慶富3

1(安順學(xué)院化學(xué)與生物農(nóng)學(xué)系，貴州安順，561000) 2(安順學(xué)院資源管理與環(huán)境科學(xué)系，貴州安順，561000)3(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)，550001)

為了研究甘薯葉總黃酮含量測(cè)定方法，文中采用超聲波輔助提取甘薯葉中的總黃酮，通過(guò)波長(zhǎng)掃描確定了AlCl3-KAC顯色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法的最大吸收峰波長(zhǎng)分別為360nm和500nm;比較了分光光度法2種空白對(duì)照的制作方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，最終根據(jù)測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)誤差、標(biāo)準(zhǔn)差、方差、峰度、偏度等指標(biāo)確定最適顯色法。結(jié)果表明:波長(zhǎng)在500 nm處以蒸餾水為空白的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法是甘薯葉總黃酮含量測(cè)定的最適方法，該法穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，對(duì)甘薯其他部位總黃酮含量測(cè)定有較好的參考價(jià)值。

甘薯，黃酮含量，測(cè)定方法

甘薯，又稱紅薯、番薯和地瓜，屬旋花科植物，原產(chǎn)于美洲中部和南美洲西北部的熱帶地區(qū)［1］?，F(xiàn)廣泛種植于中國(guó)各地，目前中國(guó)甘薯的常年種植面積占世界總種植面積的80%以上。甘薯通常以食用塊根為主，我國(guó)每年近億噸的甘薯莖葉(除部分地區(qū)作為飼料外)多數(shù)被拋棄掉，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。所以、對(duì)甘薯藤葉進(jìn)行資源化利用，有較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物。它能清除生物體內(nèi)的自由基，具有抗氧化作用［1］。關(guān)于黃酮類物質(zhì)的測(cè)定，常采用比色法和HPLC法。由于HPLC法儀器昂貴，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物的較難獲得，其應(yīng)用受到一定的限制。而比色法方便簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)用較廣，黃酮測(cè)定用到的分光光度法主要有AlCl3-KAC顯色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法2種，但是在已有報(bào)道中，這2種方法都被用于甘薯黃酮測(cè)定，本研究通過(guò)對(duì)2種分光光度法的比較，確定了甘薯葉的總黃酮最適測(cè)定方法，取得了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘薯葉，采自貴州師范大學(xué)植物遺傳育種研究所。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自貴州迪大生物有限公司;其他試劑為分析純。

DHG-90A(101AB)干燥箱，上海索譜儀器有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) UV-1800，島津公司;AR1140電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司;WB-400小型高速粉碎機(jī)，北京維博創(chuàng)機(jī)械設(shè)備有限公司;TDL-5C型低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;AKJY-20超純凈水機(jī)，艾柯;KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山超聲儀器有限公司;PHS-3C型酸度計(jì)，上海虹儀儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃酮的提取

取100 g甘薯葉60°C烘至恒重，粉碎后過(guò)40目，準(zhǔn)確稱取0.3 g干粉，溶于體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇中，固液比 1∶20(g∶mL)，溫度 40°C，每次 20 min，提取3次，超聲波功率178.5 W，超聲提取前靜置5 min，提取液2 000 r/min離心3 min，合并提取液即為黃酮提取液。

1.2.2 兩種測(cè)定方法的波長(zhǎng)掃描

1.2.2.1 AlCl3-KAC顯色法

AlCl3-KAC顯色法參考文獻(xiàn)［3］，并稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確吸取提取液1 mL，依次加入0.1 mol/L AlCl32 mL、1 mol/L乙酸鉀3 mL，最終用甲醇溶液定容至10 mL，搖勻，室溫下放置30 min。在4 000/min速度下離心10 min，在200～1 000 nm區(qū)間內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，根據(jù)最大吸收峰確定測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法參照文獻(xiàn)［4］，并稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確吸取提取液1 mL，依次加入2mL

去離子水、0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉混合，振蕩后靜止放置6 min，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁，振蕩后靜置6 min，然后加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaOH，振蕩后靜置15 min.最后用去離子水定容至9 mL，在200～1 000 nm區(qū)間內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，根據(jù)最大吸收峰確定測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.3 兩種測(cè)定方法結(jié)果的比較

本研究采用2種空白對(duì)照的制作方法:方法(1):以蒸餾水為空白;方法(2):空白對(duì)照不添加顯色劑(AlCl3或Al(NO3)3)，其他試劑與樣品制作時(shí)添加的相同。將樣品的吸光度值減去空白對(duì)照的吸光度值獲得吸光度值，以最終獲得吸光度值。最后運(yùn)用SPSS17.0對(duì)2種方法獲得的吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)比2種方法的優(yōu)劣。

2 結(jié)果

2.1 兩種測(cè)定方法的波長(zhǎng)掃描結(jié)果

通過(guò)對(duì)2種測(cè)定方法進(jìn)行的波長(zhǎng)掃描(見(jiàn)圖1)，AlCl3-KAC顯色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法最大吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)分別為361、498 nm，故2種方法測(cè)定時(shí)選取的波長(zhǎng)分別為360、500 nm。

圖1 兩種測(cè)定方法的波長(zhǎng)掃描圖

2.2 兩種測(cè)定方法結(jié)果的比較

由圖2、圖3知，單從樣品的吸光度值測(cè)定曲線看，AlCl3-KAC顯色法穩(wěn)定性明顯強(qiáng)于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法。樣品的吸光度值減去空白對(duì)照的吸光度值獲得最終的測(cè)定結(jié)果，由圖4知，以蒸餾水為空白對(duì)照的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法在600 s內(nèi)吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)誤差、標(biāo)準(zhǔn)差、方差、峰度、偏度等指標(biāo)上均優(yōu)于其他曲線(見(jiàn)表1)，可見(jiàn)、甘薯葉總黃酮含量測(cè)定最適方法為以蒸餾水為空白對(duì)照的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法。

圖2 AlCl3-KAC顯色法吸光度值隨時(shí)間變化圖

圖3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法吸光度值隨時(shí)間變化圖

圖4 600 s內(nèi)測(cè)量值變化曲線

表1 兩種測(cè)量方法吸光度值的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論與結(jié)論

可見(jiàn)及紫外分光光度法是黃酮測(cè)量常用的方法，該方法有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)前使用較多的可見(jiàn)及紫外分光光度法有NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法和 AlCl3-KAC顯色法 2種，而由于AlCl3-KAC顯色法獲得的黃酮含量的測(cè)量值比實(shí)際的要低，所以，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法的使用更為普遍，大約70%的已有報(bào)道使用該法。在已有報(bào)道中分光光度法空白對(duì)照的制作方法有2種:方法(1)以蒸餾水為空白;方法(2)空白對(duì)照不添加顯色劑［本研究為AlCl3或Al(NO3)3］，其他試劑與樣品制作時(shí)添加的相同。在這2種制作方法中，方法(1)是早期常用到的空白制作方法，而方法(2)排除了顯色劑以外試劑的影響，被認(rèn)為是改進(jìn)的和更好的空白對(duì)照制作方法，但在本研究中使用空白對(duì)照制作方法(1)的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。另外、本研究對(duì)2種測(cè)量方法進(jìn)行的波長(zhǎng)掃描(200～1 000 nm)，確定了 AlCl3-KAC顯色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法最大吸收峰波長(zhǎng)分別為:360、500 nm。故在500 nm處以蒸餾水為空白的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法是甘薯葉總黃酮含量測(cè)定的最適方法，該法可以為甘薯其他組織中總黃酮含量的測(cè)定提供參考。

［1］ 中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1979，64(1):88 －90.

［2］ 延璽，劉會(huì)青，鄒永青，等.黃酮類化合物生理活性及合成研究進(jìn)展［J］.有機(jī)化學(xué)，2008，28(9):1 534 －1 544.

［3］ NY/T1295－2007.蕎麥及其制品中總黃酮含量的測(cè)定［S］.

［4］ 楊磊，賈佳，祖元?jiǎng)?山楂屬果實(shí)提取物的體外抗氧化活性［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2009，9(4):28－32.

Study on the Determination of Flavonoid in Sweet Potato Leaves

Li Guang1，3，Yu Shuang2，3，Deng Yin3，Chen Qin-fu3
1(Department of Chemistry and Biological Agronomy，Anshun University，Anshun，561000，China)2(Department of resource and environment，Anshun University，Anshun 561000，China);3(School of Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China)

Ultrasonic-assisted method was used to extract flavonoids from Sweet Potato leaves.By the wavelength scan，we found that the maximum absorption peak wavelength of AlCl3-KAC colorimetric method is 360 nm and the maximum absorption peak wavelength of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method is 500 nm.The two different blank controls by spectrophotomretry on final the results were compared.The best methods was selected based on standard error，standard deviation，variance，kurtosis and partial degree.The results show that NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method at the wavelength of 500 nm with distilled water as blank is the best way.This method is reproducible and convenient，and can be used to detect flavonoids contents in other parts of Sweet Potato.

sweet potato，flavonoids contents，measuring method

博士研究生，講師(陳慶富教授為通訊作者，E-mail:cqf1966@163.com)。

*貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY字［2010］3014)

2011－08－22，改回日期:2011－11－07