HPLC法測定山綠茶中蘆丁的含量

劉 浩，康建黨，李建勛，盧鵬偉

（1.河南省健康偉業(yè)醫(yī)藥科技有限公司，河南 鄭州450000；2.河南省醫(yī)藥技師學(xué)院，河南 開封475003）

山綠茶為冬青科植物海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）的干燥葉，主要分布于廣西、廣東一帶。山綠茶為廣西少數(shù)民族民間中草藥，使用歷史悠久，已收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1990版）［1］。山綠茶具有清熱解毒、消腫止痛、活血通脈的功效，主要用于降血壓［2］、降血脂、降膽固醇，也用于冠心病、腦血管意外所致的偏癱以及風(fēng)熱感冒、肺熱咳嗽、咽喉水腫、扁桃體炎、痢疾等病癥的治療。山綠茶降壓片標(biāo)準(zhǔn)中，只有2項鑒別，無含量測定項目。為定量控制藥材質(zhì)量，以主要有效成分蘆丁作為指標(biāo)，建立反相高效液相色譜測定法測定山綠茶藥材的含量。實驗結(jié)果表明，本方法穩(wěn)定、可靠、精密度高，適合于山綠茶藥材的質(zhì)量定量控制。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

Lab Alliance PC-4000高效液相色譜儀；Model 500紫外檢測器；Model LA-100柱溫箱；CBM-102色譜工作站（Shimadzu）。

1.2 藥品與試劑

乙腈為色譜純（德國Merk公司）；水為純化水；試劑、試藥均為分析純；蘆丁對照品（批號為100080-200306，供含量測定用，購自中國藥品生物制品檢定所）。

2 含量測定

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

色譜柱：Waters公司C18柱4.6mm×250mm，5μm；流動相：乙腈－體積分數(shù)為2.5%醋酸溶液（15∶85）；檢測波長：254nm；流速：1.0mL／min；理論板數(shù)按蘆丁峰計算應(yīng)不低于2 500；蘆丁主峰與前后相鄰2峰的分離度不得小于1.5。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品適量，加甲醇制成0.1g／L的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備方法研究

蘆丁溶于熱甲醇及乙醇中［3］，為選擇合適的提取溶媒與提取方法，取同批山綠茶藥材粗粉1g，精密稱定，共取4份，2份加甲醇50mL，另2份加乙醇50mL，置錐形瓶中，分別按照表1提取方法提取、濾過，用甲醇適量分次洗滌容器與濾渣，洗液以同一濾器濾過，濾液合并、蒸干，殘渣用甲醇溶解并移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定，按外標(biāo)法計算蘆丁的含量，結(jié)果見表1。

表1 不同溶媒超聲及回流提取測定結(jié)果

結(jié)果表明，甲醇提取所得結(jié)果高于乙醇提取，熱回流提取結(jié)果比超聲提取結(jié)果高。因此，選擇甲醇作為溶媒，加熱回流，提取制備供試品溶液。

為選擇合適的提取時間，同上述方法，分別加甲醇后提取0.5、1.0、1.5、2.0h，依照上述方法制備成供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀測定，按外標(biāo)法計算蘆丁的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同提取時間蘆丁含量測定結(jié)果

由此可見，甲醇回流1h可基本將樣品中的蘆丁完全提取。因此，確定本品蘆丁含量測定方法為：取山綠茶粗粉1g，精密稱定，加甲醇50mL，加熱回流1h，濾過，用甲醇適量分次洗滌容器與濾渣，洗液以同一濾器濾過，濾液合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解并移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液進行進樣分析。

2.4 線性關(guān)系考察

稱取蘆丁對照品22.91mg，置25mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，甲醇至刻度，搖勻。分別精密量取對照品溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液各20μL，注入液相色譜儀中，在上述色譜條件下測定蘆丁峰面積。濃度分別為0.018 33、0.054 98、0.091 64、0.128 30、0.165 00、0.183 30g／L，對應(yīng)峰面積分別為680 192、2 069 645、3 399 468、4 652 477、6 095 039、6 772 013。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以蘆丁峰面積積分值為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：A＝3.673×107C＋1.745×104，r＝0.999 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 精密度實驗

取同批山綠茶制成的供試品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進樣5次，每次20μL，測定蘆丁峰面積，并計算5次測定結(jié)果的相對偏差。5次進樣峰面積分別為3 191 891、3 195 683、3 233 968、3 201 731、3 146 478，平均峰面積為3 193 950，RSD為0.98%。實驗結(jié)果表明，方法精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

精密吸取同批山綠茶制成的供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定蘆丁峰面積，并隨后每隔一定時間再次精密吸取20μL，依法操作，測定蘆丁峰面積，直至24h。結(jié)果表明，供試品溶液中的蘆丁在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，見表3。

表3 山綠茶蘆丁含量測定穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.7 重復(fù)性實驗

取同批山綠茶藥材粗粉5份，每份1g，精密稱定，依法制成供試品溶液，進樣操作測定，計算蘆丁含量及測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。5次測定藥材粗分含量分別為0.048 3%、0.047 8%、0.048 9%、0.048 1%、0.047 9%，平均值為0.048 2%，RSD為0.90%。結(jié)果表明，方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收實驗

取上述已測定含量的山綠茶粗粉0.5g，精密稱定，分別加蘆丁對照品溶液（0.402g／L）0.5、0.6、0.7mL，待溶劑揮發(fā)干以后，依法制成供試品溶液，測定，計算回收率。實驗結(jié)果表明，回收率較好，見表4。

2.9 日間精密度實驗

取批號為050712的山綠茶藥材內(nèi)容物2份，每份1g，精密稱定，依法制成供試品溶液，進樣操作測定。連續(xù)5d同法操作測定，分別計算每天測定的每粒膠囊中蘆丁的含量及5d測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。第1、2、3、4、5 天 測 得 含 量 分 別 為 0.045 9%、0.045 3%、0.046 1%、0.045 4%、0.046 0%，平均含量為0.045 7%，RSD為0.79%。結(jié)果表明，方法精密度較好。

2.10 10批山綠茶藥材蘆丁含量測定

取10批山綠茶樣品，分別依法測定，同時另取本品粗粉測定水分［4］，按干燥品計算含量，蘆丁含量在0.044 8%～0.060 3%之間。因此，將山綠茶藥材蘆丁含量定為按干燥品計算，不得少于0.044%，結(jié)果見表5。

表4 山綠茶蘆丁含量測定加樣回收實驗結(jié)果

表5 山綠茶藥材中蘆丁含量測定結(jié)果（%）

3 討論

3.1 流動相選擇

根據(jù)蘆丁的極性大小，并參考有關(guān)文獻［5－6］，選擇甲醇－水－冰醋酸（40∶57.5∶2.5）、甲醇－乙腈－水－冰醋酸（30∶10∶57.5∶2.5），乙腈－體積分數(shù)2.5%醋酸（15∶85）3種不同的流動相體系，考察蘆丁出峰時間、與臨近峰分離度、理論板數(shù)等分離情況。結(jié)果顯示，乙腈－體積分數(shù)2.5%醋酸為流動相的峰形對稱性、理論板數(shù)以及樣品的分離度均明顯優(yōu)于其他2個體系。

3.2 檢測波長的選擇

取蘆丁對照品適量加甲醇制成0.1g／L的溶液，用分光光度法測定溶液在254nm與358nm的波長處有最大的吸收，在高效液相色譜儀上采用雙波長檢測器檢測，當(dāng)檢測波長在254nm時，峰面積較大，故以254nm為檢測波長。

3.3 提取溶劑及時間的選擇

由于蘆丁溶于熱甲醇及乙醇，故在選擇供試品溶液的制備方法時，對提取溶媒、提取方法及提取時間進行了考察，結(jié)果表明，采用甲醇回流1h可基本將樣品中的蘆丁提取完全。

［1］廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)［S］.南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1990：137－138.

［2］陳一.山綠茶的降壓作用［J］.中草藥，1983，14（4）：27－30.

［3］許海琴，許列琴，許江葦，等.常用天然提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考手冊［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：129－130.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄IXH.

［5］文東旭，鄭學(xué)忠，井上謙一郎，等.海南冬青的化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，1999，24（4）：223－225.

［6］趙登飛.HPLC測定山綠茶膠囊中蘆丁的含量［J］.中成藥，2002，24（9）：724－725.