應(yīng)用重疊延伸法合成人源明膠基因及其克隆

段慧明,陳勁春

(北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100029)

明膠是一種從動(dòng)物(牛、馬 豬)的膠原結(jié)締組織和皮經(jīng)過一系列化學(xué)處理以后所得到的蛋白質(zhì)．干燥后的明膠涂層呈透明狀，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度．在感光工業(yè)， 醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)以及其他工業(yè)中獲得非常廣泛的應(yīng)用．明膠因使用原料、生產(chǎn)方式和質(zhì)量不同又分為食用明膠、醫(yī)用明膠、工業(yè)明膠、骨膠和照相用膠等．明膠可以從許多不同來源的膠原蛋白制取．牛骨、皮、豬皮和魚是主要的商業(yè)來源．因此，它可能來源于農(nóng)業(yè)或者非農(nóng)業(yè)．明膠也用作啤酒的澄清劑和很多產(chǎn)品的穩(wěn)定劑、增稠劑和組織形成劑．

目前國(guó)內(nèi)還沒有表達(dá)重組明膠的相關(guān)報(bào)道，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)明膠都是通過物理化學(xué)方法提取獲得．制造明膠的過程包括從動(dòng)物組織提取膠原并將其轉(zhuǎn)化成明膠．這個(gè)過程產(chǎn)生大小和電荷均不同的多肽異源混合物．使用微生物系統(tǒng)制造明膠是另一種策略．這種策略包括通過表達(dá)具有特定長(zhǎng)度和組成的膠原基因片段直接產(chǎn)生明膠．使用這些膠原片段的研究表明它們能被用作明膠的許多醫(yī)學(xué)用途的動(dòng)物源明膠的替代品[1]．

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆質(zhì)粒pGEM-T、T4DNA連接酶購自Promega公司，pfu、Taq酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、SnabⅠ、SalⅠ購自Takara公司．玻璃奶購自博大泰克公司，DNAMarker購自華美公司．其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純．PCR引物由Invitrogen 公司合成,PCR反應(yīng)在PERKIN ELMER公司2400型擴(kuò)增儀上進(jìn)行．

培養(yǎng)基：LB、LB固體平板按英駿公司的方法配制．

1.2 分子克隆常規(guī)操作

質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物回收參照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行．

1.3 寡核苷酸片段的合成

參照人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈結(jié)構(gòu)基因的序列選取了α1鏈第531～630個(gè)氨基酸的編碼序列設(shè)計(jì)人工合成該基因的方案．并且首先將該基因的序列進(jìn)行遺傳密碼的優(yōu)化設(shè)計(jì)，即根據(jù)密碼子使用偏好把人的編碼方式改變?yōu)楫叧嘟湍傅木幋a方式，將編碼膠原蛋白的基因分成10段，相鄰兩個(gè)片段之間的互補(bǔ)序列長(zhǎng)度為17～20個(gè)堿基．在該基因的5＇端引入了SnabⅠ酶切位點(diǎn)，在3＇端引入了HindⅢ酶切位點(diǎn)．全基因序列的劃分情況如表1所示(帶下劃線處均為重疊區(qū)), 寡核苷酸片段的合成由北京英駿公司完成．

表1 化學(xué)合成人源明膠基因的寡核苷酸片段

1.4 寡核苷酸片段的連接和組裝

采用重疊延伸PCR技術(shù)，按如下方法將寡核苷酸片段連接成一完整人源明膠基因：①將明膠基因片段1～10分別重疊延伸形成寡核苷酸片段(1～4)、(5～8)、(9～10)，PCR反應(yīng)體系為0.2 μL dNTP(25 mmol/L)、0.2 μL pfu酶、2 μL 10×Buffer、寡核苷酸片段、純凈水16.8 μL,總反應(yīng)體系為20 μL．PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min→[94 ℃，1 min→64 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min] ×25個(gè)循環(huán)→72 ℃ 10 min→4 ℃；②將步驟①得到的PCR產(chǎn)物回收后按(1～4)→(5～8)連接，反應(yīng)體系為0.2 μ LdNTP(25mmol/L)，引物1和引物8各0.5 μL, 2 μL 10×Buffer, (1～4) 和 (5～8)回收片段各0.5 μL, 0.2 μLpfu酶, 純凈水15.6 μL,總反應(yīng)體系為20 μL．PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min→[94 ℃，1 min→55 ℃ 1 min→72 ℃ 5 min] ×1個(gè)循環(huán)(獲得1～8模板)，暫停加引物1和8各0.5 μL→94 ℃預(yù)變性5 min →[94 ℃，1 min→64 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min] ×25個(gè)循環(huán)→72 ℃ 10 min→4 ℃;③將步驟②得到的PCR產(chǎn)物回收后按(1～8)→(9～10)連接,反應(yīng)體系為0.2 μL dNTP(25 mmol/L)，引物1和引物10各0.5 μL, 2 μL 10×Buffer, (1～8) 和 (9～10) 回收片段各0.5 μL, 0.2 μL pfu酶, 純凈水15.6 μL, 總反應(yīng)體系為20 μL ,PCR反應(yīng)條件同步驟2．至此，得到全基因．

1.5 人源明膠基因的克隆

以1.4中得到的(1～10)為模板, 用引物1和引物10擴(kuò)增得到全基因，PCR反應(yīng)體系為：0.5 μL dNTP(25 mmol/L)、0.5 μL Taq酶、1 μL(1～10)模板、引物1和引物10各1 μL，5 μL 10×Buffer，41 μL 水，總反應(yīng)體系為50 μL，PCR反應(yīng)條件同上．PCR反應(yīng)后走15 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 檢測(cè)擴(kuò)增片段的大小和特異性, 將目的片段切下, 用玻璃奶法回收純化目的片段．

1.6 目的片段的克隆及重組子篩選

將回收的目的片段克隆到Promega公司的pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含有氨芐青霉素的平板上，培養(yǎng)過夜，挑取菌落接種培養(yǎng)，用堿變性法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的小量提取，酶切鑒定．

1.7 DNA序列測(cè)定

將鑒定正確的菌液送英駿公司對(duì)擴(kuò)增的目的基因片段測(cè)序確定堿基序列．

2 結(jié)果

2.1 組裝與克隆

組裝與克隆步驟如圖1所示.

圖1 化學(xué)合成基因流程圖

2.2 PCR 擴(kuò)增及其產(chǎn)物的電泳鑒定結(jié)果

以PCR產(chǎn)物1～10為模板,引物1和10分別為上游和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件見方法1.4,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果見圖2．

2.3 人源明膠基因的全序列測(cè)定

經(jīng)過測(cè)序，序列與理論序列一致，該基因全長(zhǎng)300 bp，帶下劃線處分別為SnabⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn).

1：明膠基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M：100 bp DNA plus圖2 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3 討論

膠原蛋白的結(jié)構(gòu)基因由于具有三聯(lián)體Gly-X-Y結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列較高，采用傳統(tǒng)的磷酸化補(bǔ)齊方法很難獲得目的基因，而重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,簡(jiǎn)稱SOE PCR)[2-3]由于采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來． 其原理是: 使用2對(duì)引物P1，P2和P3，P4經(jīng)過第一輪PCR分別擴(kuò)增出2個(gè)DNA片段A和B，其中P2和P3為內(nèi)引物，具有部分序列重疊互補(bǔ)，使A的3′端和B的5′端具有同源互補(bǔ)序列; 第二輪PCR再以A和B混合作為模板，經(jīng)變性，退火，復(fù)性時(shí)，A的正鏈和B的負(fù)鏈的3′端同源互補(bǔ)序列將結(jié)合在一起，使兩條鏈互為引物，通過PCR得到延伸和擴(kuò)增，從而連接A和B． 其特點(diǎn)是不需要使用限制性內(nèi)切酶和連接酶，可以避免引入限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列，可將2個(gè)DNA片段精確地連接在一起． 使用這種方法時(shí)，為了盡可能避免或減少堿基錯(cuò)配，往往需加大模板、引物和dNTP的用量，同時(shí)減少PCR的循環(huán)數(shù)，因此有時(shí)在其PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖像中仍可見模板DNA的相應(yīng)條帶．因此應(yīng)用SOE時(shí)，每一輪PCR產(chǎn)物最好經(jīng)電泳分離后切膠回收純化以除去多余的引物和其他非特異序列．此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組,而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理,可利用這一技術(shù)很快獲得其他依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物．重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)．重疊延伸PCR在基因的定點(diǎn)突變、融合基因的構(gòu)建、長(zhǎng)片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用．

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