鯉魚腦垂體和HCG誘導(dǎo)雌性河鰻性腺成熟過(guò)程中鈣磷變化的初步研究

高曉陽(yáng)，劉利平，蔣天寶，陳文銀，吳嘉敏

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 上海 201306)

河鰻學(xué)名為日本鰻鱺，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的生殖洄游性魚類，素有“水中人參”之稱．仔鰻在淡水中生長(zhǎng)發(fā)育3～5年后，在秋冬季成群地游向大海開始生殖洄游．河鰻進(jìn)入海水后，性腺逐漸發(fā)育成熟，在海洋中產(chǎn)卵．在生殖洄游整個(gè)過(guò)程中，河鰻不攝食[1-2]，其物質(zhì)和能量來(lái)源主要由身體的儲(chǔ)存供給[3]．20世紀(jì)80年代以來(lái)，世界養(yǎng)鰻業(yè)迅速發(fā)展，尤其是在我國(guó)，河鰻已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中產(chǎn)業(yè)化程度最高的品種之一．然而，由于養(yǎng)殖所需的苗種完全依靠天然捕撈，掠奪式的捕撈方式致使鰻苗資源逐年下降．河鰻苗種短缺限制了鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，開展河鰻人工繁殖技術(shù)研究勢(shì)在必行．國(guó)內(nèi)一般通過(guò)注射外源激素如腦垂體和HCG等促使河鰻親魚性腺發(fā)育成熟、產(chǎn)卵，但親魚的產(chǎn)卵率和卵子受精率都很低．卵子發(fā)育需動(dòng)用身體儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而關(guān)于成熟過(guò)程中生化指標(biāo)的變化少見報(bào)道．本文模擬自然條件實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不投喂餌料，從注射鯉魚腦垂體和HCG(人絨毛膜促性腺激素)的雌性河鰻鈣、磷指標(biāo)的變化入手，探討其轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化規(guī)律，為河鰻親魚強(qiáng)化培育和人工繁殖的突破提供基礎(chǔ)性參考資料．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用63尾親魚均購(gòu)自上海市惠南鎮(zhèn)天英河水產(chǎn)經(jīng)營(yíng)部池塘養(yǎng)殖鰻鱺，選擇體質(zhì)健壯，無(wú)病害的鰻鱺為實(shí)驗(yàn)用魚．雌鰻體重為845～1 020 g．所有親魚運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的養(yǎng)殖室海水玻璃循環(huán)系統(tǒng)中進(jìn)行養(yǎng)殖．經(jīng)15 d逐步適應(yīng)海水后，隨機(jī)分4組養(yǎng)殖于鹽度為28的海水中，試驗(yàn)期間水溫為16～25 ℃．

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)共分4組．第1組恒量注射腦垂體和HCG；第2組梯度注射腦垂體和HCG(腦垂體和HCG均溶解在7 g/L生理鹽水中)，第1組和第2組最后注射激素劑量相同；第3組注射等量的7 g/L生理鹽水；第4組不做任何處理只養(yǎng)殖在海水循環(huán)系統(tǒng)中．每周注射1次，注射方式為背部肌肉注射，注射劑量如下表所示.

表1 實(shí)驗(yàn)分組和激素注射方法

1.3 樣品采集及分析

每?jī)芍懿梢淮螛悠?，每組3尾魚，邊注射邊取樣．在注射第1針分組前先隨意挑選3尾雌性親魚，用MS-222完全麻醉魚體，解剖魚體計(jì)算性腺成熟系數(shù)(GSI)和肝體系數(shù)(HSI)； 采集性腺、肝臟、肌肉、骨骼，存放于-20 ℃冰箱，測(cè)定前把樣品放入冷凍干燥機(jī)完全干燥樣品，測(cè)定干燥樣品鈣、磷含量,測(cè)定方法參考林鼎等[4]方法進(jìn)行測(cè)定；用5 mL一次性無(wú)菌注射器動(dòng)脈采血，取完血后，將血液注入肝素鈉抗凝血的玻璃采血管中4 ℃冰箱放置2～4 h，待血液凝固析出血清后，將血樣4 ℃下4 000 r/min離心15 min,取血清用于血液鈣、磷等成分分析．用全自動(dòng)血液生化分析儀(邁瑞B(yǎng)S-200)分析血清中鈣、磷含量．

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用spss(Version 11.5)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，利用單因素方差分析(Oneway ANOVA)來(lái)檢驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組生化指標(biāo)間的顯著性，用Duncan’s進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)．

2 結(jié)果與分析

2.1 注射腦垂體和HCG對(duì)性腺成熟系數(shù)的影響

經(jīng)過(guò)70 d的發(fā)育過(guò)程，恒量組和梯度組雌性河鰻的性腺成熟系數(shù)達(dá)到(25.2±4.35)%和(24.8±4.72)%，而對(duì)照組和空白組僅為(2.42±0.18)%和(1.93±0.13)%，對(duì)照組性腺成熟系數(shù)增幅比空白組稍大，但是沒有明顯的差異(P﹥0.05)；空白組性腺有一定程度的發(fā)育，但是不明顯(圖1)．

2.2 注射腦垂體和HCG對(duì)組織中鈣含量變化的影響

通過(guò)10次注射腦垂體和HCG，恒量組和梯度組的雌魚骨骼中鈣的含量明顯下降．注射激素前骨骼鈣干質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(1.017 7±0.049 4)%，而恒量組和梯度組在第70 d骨骼鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到(0.746 3±0.090 4)%和(0.747 7±0.116 6)%，與對(duì)照組和空白組有顯著性差異(P﹤0.05)(圖2)．

圖1 注射腦垂體和HCG對(duì)雌性河鰻GSI的影響

圖2 注射腦垂體和HCG對(duì)雌性河鰻骨骼鈣含量的影響

血清中鈣含量表現(xiàn)出一定的規(guī)律性變化，首先恒量組和梯度組血清中鈣含量迅速下降，在第14 d達(dá)到最小值，分別是(0.55±0.17)mmol/L和(0.534±0.11)mmol/L；然后開始上升，到性腺發(fā)育到第ⅴ期，其含量達(dá)到了最大值，分別達(dá)到(1.193±0.2)mmol/L和(1.187±0.22)mmol/L；對(duì)照組和空白組表現(xiàn)為不同程度的下降(圖3)．

恒量組和梯度組雌魚的性腺中鈣的含量明顯增加，注射激素前雌魚性腺鈣的干質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(7.3±2.92)%，而在第70 d達(dá)到了(51.4±17)%和(49.6±20.3)%．對(duì)照組和空白組與注射前沒有明顯差異 (圖4)；處理組肝臟中鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯上升，第70 d分別達(dá)到(35.2±5.41)%和(34.9±6.8)%；而空白組和對(duì)照組和注射前沒有明顯差別(圖5).肌肉中鈣含量基本無(wú)變化．

圖3 注射腦垂體和HCG對(duì)雌性河鰻血清中鈣含量的影響

圖4 注射腦垂體和HCG對(duì)雌性河鰻性腺鈣含量的影響

2.3 注射腦垂體和HCG對(duì)組織中磷含量的影響

通過(guò)10次注射腦垂體和HCG后，恒量組和梯度組骨骼中的磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第70 d分別顯著下降到(0.97±0.4)×10-5和(0.99±0.47)×10-5，而對(duì)照組和空白組含量變化不明顯(P﹥0.05)(圖6)；血清中磷含量也表現(xiàn)為一定規(guī)律的變化，首先實(shí)驗(yàn)組磷含量迅速下降，到28 d達(dá)到最小值，分別是(1.494±0.85)mmol/L和(1.168±0.73)mmol/L，然后開始上升，到70 d的時(shí)候達(dá)到(2.196±0.91)mmol/L和(2.188±1.02)mmol/L；而對(duì)照組血清中磷下降明顯，空白組變化不明顯(圖7)．注射激素的兩組雌魚中性腺的磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加，到第70 d時(shí)，處理組分別達(dá)到(0.213 3±0.073 3)%和(0.212 2±0.083 7)%，而對(duì)照組和空白組變化不顯著(圖8)；而肝臟和肌肉中磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.21～0.25)×10-5，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中4個(gè)組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)．

圖5 注射腦垂體和HCG對(duì)雌性河鰻肝臟鈣含量的影響

圖6 注射腦垂體和HCG對(duì)骨骼中磷含量的影響

圖7 注射腦垂體和HCG對(duì)血清中磷含量的影響

圖8 注射腦垂體和HCG對(duì)性腺中磷含量的影響

3 討論

雌魚在卵巢發(fā)育過(guò)程中，肝臟在17β-E2誘導(dǎo)下合成和釋放雌性特有的卵黃蛋白原．這些卵黃蛋白原經(jīng)過(guò)血液運(yùn)輸，在促性腺激素作用下進(jìn)入發(fā)育的卵母細(xì)胞在卵母細(xì)胞內(nèi)積累，形成卵黃顆粒，從而促使卵母細(xì)胞逐漸成熟，GSI逐漸增加[5]．卵黃蛋白原是雌魚特有的蛋白質(zhì)，是一種鈣結(jié)合脂磷蛋白．DOROSHOV等發(fā)現(xiàn)高首鱘在性腺發(fā)育過(guò)程中卵黃蛋白原的發(fā)生過(guò)程伴隨著Ca2+和P濃度的變化[6]；LINARES-CASENAVE等也發(fā)現(xiàn)了高首鱘在性腺發(fā)育過(guò)程中Ca2+和卵黃蛋白原的線性關(guān)系[7]；李朝軍等對(duì)大阪鯽的研究表明Ca2+能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和蛋白的吸收[8]，可見鈣在魚類卵細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起到了相當(dāng)重要的作用；在本實(shí)驗(yàn)中HIS也顯著升高，說(shuō)明肝臟中卵黃蛋白原的合成和釋放增加，以及卵巢中卵黃積累的增加．

有意思的是，本實(shí)驗(yàn)中，河鰻性腺發(fā)育過(guò)程中，肝臟和卵巢中鈣含量逐漸升高，這些鈣和磷到底是來(lái)源在哪？由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中雌鰻沒有進(jìn)食任何食物，因此除可能通過(guò)鰓從海水中攝取外，體內(nèi)各器官之間可能有鈣磷發(fā)生轉(zhuǎn)移，以滿足卵巢發(fā)育．在注射腦垂體和HCG后骨骼中的鈣含量降低，而性腺和肝臟中鈣含量增加，表明腦垂體和HCG誘導(dǎo)雌性河鰻動(dòng)員了骨骼中的鈣轉(zhuǎn)移到性腺和肝臟中,參與了性腺的發(fā)育． 17β-E2可以促使鈣從骨骼中調(diào)動(dòng)出來(lái)[9]，從有些魚類中發(fā)現(xiàn)骨骼中存在17β-E2受體，17β-E2可能通過(guò)影響其受體來(lái)影響鈣和礦物質(zhì)的含量[10]．

鈣參與魚類多種生理活動(dòng)，如參與肌肉收縮、血液凝固、神經(jīng)傳遞、滲透壓調(diào)節(jié)和多種酶反應(yīng)等過(guò)程，也與保持生物膜的完整性有關(guān)．魚體缺鈣時(shí)生長(zhǎng)緩慢，食物轉(zhuǎn)換率低，死亡率高． 魚體的鈣99%以上存在于骨骼內(nèi)，血鈣全部存在于血清中，細(xì)胞中只有極微量的鈣質(zhì)[11]．魚類血液生化指標(biāo)雖然受諸多因素的影響，但仍然能夠反應(yīng)該魚類健康狀況和生理狀況[12],性別和性成熟是影響魚類血液生化指標(biāo)的重要因素[13]．葉勤等已經(jīng)證實(shí)血清游離Ca2+在魚類生殖期生理活動(dòng)中起重要作用[14]．因此測(cè)定血清和組織中鈣的含量有助于了解鈣與雌鰻性腺發(fā)育的相互關(guān)系，為河鰻的人工繁殖積累基本的理論依據(jù)．本實(shí)驗(yàn)測(cè)得雌魚性腺發(fā)育到第Ⅱ期后，鈣含量出現(xiàn)波動(dòng)下降，從第Ⅲ期、第Ⅳ和第Ⅴ期鈣含量明顯上升；這與葉勤等測(cè)定嘉陵江瓦氏黃顙魚雌魚血清鈣含量隨卵巢發(fā)育逐漸上升[14]這一結(jié)果比較相似．葉勤等[14]和張濤等[15]還發(fā)現(xiàn),卵巢發(fā)育后期血清中鈣含量逐漸下降，這些結(jié)果與作者得到的結(jié)論有不同之處，有待進(jìn)一步研究．SUBHEDAR等認(rèn)為在誘導(dǎo)性成熟過(guò)程中，斯氏小囊的活動(dòng)對(duì)于從血庫(kù)中調(diào)動(dòng)鈣的儲(chǔ)存并輸送到正在發(fā)育成熟的性腺中可能起重要作用[16]，這與作者研究性腺發(fā)育整個(gè)過(guò)程調(diào)動(dòng)血清中鈣類似，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)腦垂體和HCG誘導(dǎo)雌性河鰻發(fā)育初期血清中鈣含量也有迅速下降的趨勢(shì)，有可能就是斯氏小囊調(diào)動(dòng)了血庫(kù)中的鈣，再次證明鈣在魚類生殖生理活動(dòng)中起著重要作用．

磷在糖和脂肪的代謝中起重要作用，還參與能量轉(zhuǎn)化，維持細(xì)胞的通透性，遺傳密碼和生殖活動(dòng)的調(diào)控．魚體缺磷則使骨骼發(fā)育不正常，特別是頭部畸形，血細(xì)胞含量減少，生長(zhǎng)緩慢以及食物轉(zhuǎn)換率低．在鯉魚中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)率與食物中磷的含量呈正相關(guān)關(guān)系．因?yàn)榱自谒泻亢苌?，食物是魚類磷的主要來(lái)源,而本實(shí)驗(yàn)整個(gè)過(guò)程中河鰻不進(jìn)食任何食物，但是隨著性腺的發(fā)育性腺中磷含量逐漸增加，血液中磷含量經(jīng)歷短暫的下降后也逐漸上升，骨骼中磷含量顯著減少．說(shuō)明整個(gè)過(guò)程調(diào)動(dòng)了骨骼中的磷通過(guò)血液轉(zhuǎn)移到了性腺供性腺的發(fā)育．魚類血液生化指標(biāo)能反應(yīng)魚類的物種特征及其生理狀態(tài)，還能為繁殖等提供重要參考依據(jù)[17]．張濤等也證實(shí)了雌性鱘魚血漿中無(wú)機(jī)磷含量隨著性腺發(fā)育顯著升高[15]，李云等[18]和王友惠等[19]在對(duì)瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)的研究中發(fā)現(xiàn),隨著雌魚性腺的發(fā)育，血清中磷濃度逐漸升高，到Ⅳ期末達(dá)到最大值；這和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似．本實(shí)驗(yàn)注射激素前期血清中磷含量經(jīng)歷了短暫的下降，原因可能是魚不同，其變化規(guī)律稍有不同．據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道除了鈣、磷以外還有其他生化指標(biāo)也有一定的變化如蛋白、脂肪、灰分等．肖亞梅等[20]發(fā)現(xiàn)黃鱔不同時(shí)期性腺發(fā)育蛋白差異和張利紅等[4]發(fā)現(xiàn)鰻鱺不同發(fā)育時(shí)期脂肪差異．變化機(jī)理有待進(jìn)一步研究．

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