辣椒小孢子母細胞減數(shù)分裂過程中微管的分布變化

劉勝姿，王留英，邱義蘭*，劉如石，王曉輝，劉少軍

(1.湖南師范大學醫(yī)學院，中國 長沙 410081; 2.湖南師范大學生命科學學院，中國 長沙 410081)

微管作為細胞骨架主要成分之一，廣泛存在于真核生物細胞中．在植物細胞中，微管通過分布狀態(tài)的變化與微絲共同參與眾多的生命活動，如細胞形態(tài)建成、染色體遷移、細胞分裂與分化、細胞壁構建和信號傳導等[1-4]．到目前為止，有關高等植物有性生殖過程中細胞骨架的研究主要集中于花粉的萌發(fā)和生長與細胞骨架變化動態(tài)的關系[5-11]．有關高等植物雄性細胞發(fā)育早期減數(shù)分裂過程中細胞骨架的研究則不多[12-16]．高等植物不同種植物的減數(shù)分裂特征不同，其微管骨架的分布變化也存在差異．本實驗對辣椒 (CapsicumannumL.) 減數(shù)分裂過程中的微管變化進行了觀察，探索其微管骨架分布特征，為豐富高等植物減數(shù)分裂過程中細胞骨架的作用奠定基礎．

1 材料與方法

供試材料為辣椒(CapsicumannumL.) 牛角椒2號品種．4月中旬種植于湖南師范大學生命科學學院植物生理網(wǎng)室．取花芽分化后減數(shù)分裂各個時期的花藥，依次進行以下處理．

固定：用含有40 g/L多聚甲醛、100 g/L蔗糖、50 mmol·L-1PIPES緩沖液 (pH 6.9)、100 g/L二甲基亞砜和10 g/LTriton X-100的固定液在室溫條件下固定1 h，然后用50 mmol·L-1PIPES緩沖液 (pH 6.9) 沖洗3次, 每次5 min．取出花藥, 在涂有多聚賴氨酸溶液的載玻片上, 輕壓花藥使藥室內(nèi)的花粉細胞逸出．

酶解：將10 g/L的蝸牛酶(50 mmol·L-1PIPES緩沖液配制, pH 6.9)覆蓋于細胞之上, 室溫保濕酶解10～15 min．酶解后, 用50 mmol·L-1PIPES緩沖液(pH 6.9)沖洗3次，每次5 min．

免疫反應預處理: 用10 g/L的牛血清蛋白溶液(50 mmol·L-1PIPES緩沖液配制, pH 6.9)封閉細胞1 h, 并用含NaCl 138 mmol·L-1、KCl 2.68 mmol·L-1、KH2PO41.47 mmol·L-1、Na2HPO48.1 mmol·L-1磷酸緩沖液 (PBS) 洗3次，每次5 min．

微管免疫反應: 經(jīng)上述處理過的細胞, 先與一抗——鼠抗微管蛋白(Sigma, PBS緩沖液稀釋, 稀釋度為1∶350)在一定濕度下37 ℃溫育1 h，PBS緩沖液沖洗3次, 每次10 min．再用二抗——FITC(fluorescein isothiocyanate, 異硫氰酸熒光素)標記的羊抗小鼠IgG (Sigma, PBS緩沖液稀釋, 稀釋度為1∶200) 在一定濕度下37 ℃溫育1 h, PBS緩沖液沖洗3次, 每次10 min．

染色體及細胞核的標記：先配置DAPI(4′,6-diamidine-2′-phenylindole, 4′,6二脒基-2-苯吲哚)母液(1 g/L), 用時用PBS緩沖液1∶300稀釋水溶液對細胞染色5 min, 隨即用PBS緩沖液沖洗．

封片及觀察：體積分數(shù)為20%的甘油封片后用Leica共聚焦激光掃描顯微鏡(Leica TCS SP5)及圖像處理系統(tǒng)進行觀察，F(xiàn)ITC激發(fā)波長為488 nm, DAPI激發(fā)波長為364 nm．

2 實驗結果

在小孢子母細胞時期，小孢子母細胞最顯著的特征是外面被一層厚厚的胼胝質壁包圍(圖1a)．小孢子母細胞進入減數(shù)分裂前的間期，細胞質中大部分微管蛋白呈彌散分布，只有少量的微管積聚，形成細胞周質微管，細胞核位于細胞中央(圖1b)．當小孢子母細胞由間期向分裂期過渡的時候，微管蛋白積聚成絲，呈籠形分布于細胞質中，細胞核被包裹在籠形結構之中(圖1c)．隨著進一步發(fā)育，小孢子母細胞進入減數(shù)分裂Ⅰ中期，細胞中幾乎所有的微管聚合成紡錘體，染色體排列在紡錘體的赤道板，把紡錘體分隔為2個半紡錘體(圖1d)．當小孢子母細胞進入減數(shù)分裂I 后期，著絲粒微管向兩極拉伸縮短，將染色體拉向兩極后，它形成扁平的帽狀結構，在2組染色體之間存在極絲微管(圖1e)，隨后在連接2組染色體的極絲微管增多，熒光強(圖1f)．至末期Ⅰ，2細胞核之間的微管熒光明顯減弱，由細胞核表明向四周輻射出一些微管(圖1g)．繼續(xù)向前發(fā)育，細胞質中絲狀的微管消失，呈現(xiàn)均勻的弱熒光，而在2個子核的周圍聚集了較多的微管，熒光很強(圖1h)．辣椒小孢子母細胞的減數(shù)分裂屬同時型，減數(shù)分裂I結束后，在2個子核之間并沒有形成細胞壁，也沒有形成二分體．當減數(shù)分裂II開始后，在小孢子母細胞中又開始形成2個紡錘體，2個子核的紡錘體平行或者呈一定的角度交叉排列，紡錘體的中間為染色體(圖1i)．進入減數(shù)分裂Ⅱ后期，著絲粒微管將染色體拉向兩極，形成2套姊妹染色體組，在姊妹染色體組之間存在極絲微管，而非姊妹染色體組之間沒有微管(圖1j)，隨后，極絲微管逐漸消失，微管集中在4套染色體組表面向四周呈輻射狀分布(圖1k)．隨著發(fā)育的繼續(xù)進行，非姊妹染色體組之間也形成微管，支持4個細胞核呈特定空間分布(圖1l)．進入減數(shù)分裂Ⅱ末期，形成4個子核，每2個子核之間均有平行的微管絲相連(圖1m)．胞質分裂是從細胞核之間的質膜向內(nèi)縊縮開始(圖1n)．隨著發(fā)育，縊縮繼續(xù)進行，連接細胞核之間的微管逐漸減少(圖1o)．最后，4個細胞核被新形成的細胞壁完全隔離，構成四分體，在四分體小孢子中的微管由細胞核表面向細胞四周呈輻射狀分布(圖1p)．

所有圖片標尺=5 μm a:辣椒小孢子母細胞被一層厚厚的胼胝質壁包裹；b:小孢子母細胞中的微管骨架的分布；c:小孢子母細胞中的微管呈籠形；d:小孢子母細胞減數(shù)分裂I中期形成紡錘體微管；e:小孢子母細胞減數(shù)分裂I后期，著絲粒微管縮短并集中在兩極呈帽形, 兩極之間存在一些極絲微管；f:細胞兩極之間的極絲微管進一步增加；g:小孢子母細胞減數(shù)分裂I末期，微管由兩個核表面往四周輻射分布；h:微管主要集中在兩個核表面；i:小孢子母細胞減數(shù)分裂II中期，微管形成兩個紡錘體；j:小孢子母細胞減數(shù)分裂II后期，兩個紡錘體微管縮短，將染色體拉向兩極，姊妹染色體組之間有一些極絲微管，非姊妹染色體組之間沒有微管；k:微管集中在4套染色體組表面向四周輻射分布；l:非姊妹染色體組之間也形成微管，支持4個特定空間分布的細胞核；m:小孢子母細胞減數(shù)分裂II末期，形成4個細胞核，核之間均形成平行的微管束；n:細胞核之間的質膜開始向心縊縮，細胞核之間的微管束減少；o:細胞質進一步縊縮，細胞核之間的微管束也進一步減少；p:胞質分裂完成后形成的四分體，在四分體小孢子中的微管由細胞核表面向細胞四周呈輻射狀分布．圖1 辣椒小孢子母細胞減數(shù)分裂過程

3 討論

在細胞分裂過程中，處于解聚和聚合動態(tài)變化中的微管骨架與染色體運動、胞質分裂和細胞壁形成密切相關．根據(jù)花粉母細胞減數(shù)分裂中胞質分裂的次數(shù)，高等植物的減數(shù)分裂可分為同時型和連續(xù)型2種類型．多數(shù)單子葉植物的花粉母細胞減數(shù)分裂為連續(xù)型，第一次分裂即產(chǎn)生新壁，形成二分體．有關玉米[17]、水稻[12]等單子葉植物減數(shù)分裂過程中微管骨架的研究表明，減數(shù)分裂細胞中主要存在3種微管類型：即減數(shù)分裂前期的核周胞質微管，中期的紡錘體微管和后期的成膜體微管．不同的微管構型在細胞中的功能不同：前期呈網(wǎng)絡狀的核周胞質微管參與了細胞核的定位及向細胞表面的物質運輸作用；中期的紡錘體微管主要是細胞分裂時將染色體拉向兩極；成膜體微管在胞質分裂時定位細胞板的位置．Shamina等[15]進一步研究了單子葉植物減數(shù)分裂I末期成膜體的形成過程，發(fā)現(xiàn)在減數(shù)分裂I末期，組成紡錘體的中部微管和一些新形成的微管向赤道板集中形成了成膜體，構成了連續(xù)型四分體的胞質分裂基礎，產(chǎn)生了二分體．然而，多數(shù)雙子葉植物為同時型，第一次分裂不產(chǎn)生新壁，無二分體階段，直到第二次分裂末期，形成4個子核后才同時產(chǎn)生細胞壁．Traas等[18]在有關胞質分裂同時型植物的研究中觀察到，在中期Ⅰ之后沒有形成成膜體，因此末期Ⅰ未形成二分體，而在末期Ⅱ后同時形成了四分孢子．在本實驗中，作者觀察到辣椒小孢子母細胞減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)了前期的核周胞質微管和中期的紡錘體微管．辣椒小孢子母細胞減數(shù)分裂為同時型，在其減數(shù)分裂I后期紡錘體微管沒有形成成膜體，不發(fā)生胞質分裂，沒有二分體的形成．減數(shù)分裂II后期紡錘體微管也沒有形成成膜體，到減數(shù)分裂快要結束時才通過細胞縊縮方式進行胞質分裂．由此可看出，一方面，高等植物小孢子母細胞減數(shù)分裂中同時型和連續(xù)性差異的關鍵是成膜體的形成與否．另一方面，動物細胞的胞質分裂是通過細胞縊縮方式進行的，該過程只有在微管和微絲骨架的協(xié)調(diào)作用下才能正常完成，其中微管骨架可能參與分裂溝的定位和分裂溝內(nèi)縮的起始, 而微絲骨架則主要負責分裂溝的內(nèi)縮[19]．高等植物同時型小孢子母細胞減數(shù)分裂中的胞質分裂是否像動物細胞分裂中由微絲與微管共同調(diào)控，還有待進一步的研究．

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