斑點叉尾鮰敗血癥病原的分離與鑒定

戴振炎,劉小燕,陳冬香,余建波,李權(quán)生,鐘 蕾,潘望城

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院,中國 長沙 410128； 2.安化縣移民局,中國 安化 413500)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)屬弧菌科(Vibronaceae)氣單胞菌(Aeromonas)，為嗜溫、有運動性的氣單胞菌群．是一種在水體中廣泛存在的細菌，可引起魚類及其它水生動物多種疾病[1-2]．

斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)亦稱溝鯰，是較適宜深加工的優(yōu)質(zhì)淡水魚．我國于1984年引進該品種，并于1987年人工繁育成功[3]．目前已成為湖南名優(yōu)魚中養(yǎng)殖規(guī)模與產(chǎn)量最大的品種，速凍魚片運銷歐美和東南亞國家，具有較為明顯的經(jīng)濟效益與社會效益及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展優(yōu)勢，能進一步促進我國漁業(yè)飼料工業(yè)的發(fā)展、水產(chǎn)品加工及其出口貿(mào)易等產(chǎn)業(yè)，形成了完整的產(chǎn)業(yè)鏈．但是隨著引進時間的推移，由于養(yǎng)殖方式的不完善，經(jīng)常有新的病害發(fā)生，其中最主要的是細菌感染引起的疾病[4]．近幾年陸續(xù)在湖南柘溪水庫、五強溪水庫、鳳灘水庫等地的網(wǎng)箱養(yǎng)殖中發(fā)生了一種嚴重危害斑點叉尾鮰健康的急性型敗血癥，該病具有發(fā)病突然，死亡率高，傳染快等特點．作者以典型癥狀的病魚作為材料，分離出優(yōu)勢菌株，通過菌株的分離鑒定，并進行人工感染試驗等方法，對其致病菌進行了研究.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 患病的斑點叉尾鮰 2009年3～5月，取自湖南柘溪水庫安化庫區(qū)龍棲村和寶塔山村的網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地(成魚：平均體長24±2 cm，平均體重500±10 g；魚種：平均體長12±2 cm,平均體重45±10 g)．

1.1.2 健康的斑點叉尾鮰 取自湖南農(nóng)業(yè)大學東方鑫座斑點叉尾鮰養(yǎng)殖基地．平均體長18±2 cm，平均體重80±10 g，喂養(yǎng)在100 L的水泥池中，每天投喂1次．池中的水為曝氣48 h的自來水，水溫控制在28±2 ℃，兩天換水1次．

1.2 病原菌的分離

無菌條件下，取發(fā)病癥狀典型的瀕死斑點叉尾鮰，用無菌水沖洗干凈，再用70%的酒精棉球反復(fù)擦拭病魚的腹部和體表進行消毒，用無菌剪刀剪開腹腔，用接種環(huán)從病魚的鰓、腸壁、肝、脾、腎等處取樣，劃線接種于普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，置于電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)24～28 h后，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌落進行重復(fù)劃線純化培養(yǎng)，然后將純化的菌株轉(zhuǎn)接種到斜面培養(yǎng)基于4 ℃保存?zhèn)溆肹5]．

1.3 人工感染試驗

1.3.1 病毒感染試驗 在病原菌分離的同時，將病魚的腸、肝、脾、腎等組織剪碎、勻漿，12 000 r/min離心2 min，取其上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，以無菌操作將得到的濾液進行平板劃線，28 ℃，培養(yǎng)24 h，觀察濾液是否有菌落生長，確認無菌后取10尾健康的斑點叉尾鮰，腹腔注射得到的無菌濾液，每尾注射0.4 mL；同時設(shè)對照組，每尾注射0.4 mL的無菌生理鹽水．試驗組和對照組放在28 ℃水溫的不同水池內(nèi)飼養(yǎng)，觀察斑點叉尾鮰的發(fā)病情況，并記錄結(jié)果．

1.3.2 細菌感染試驗 將分離到的細菌接種于普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水沖洗下菌苔．試驗共設(shè)4個處理，3個重復(fù)． 每個處理用叉尾鮰10尾．處理1：取無病斑點叉尾鮰，從腹鰭基部注射含菌群數(shù)為1.5×108個/mL的菌懸液，每尾注射0.4 mL ；處理2，每尾注射0.4 mL的6.5 g/L的無菌生理鹽水,作為處理1的對照．處理3：取無病斑點叉尾鮰，人為創(chuàng)傷感染，即用滅菌解剖刀劃破魚體體表皮膚，浸泡在含菌群數(shù)為5.0×108個/mL的菌懸液中2 h后轉(zhuǎn)入不同水池中正常飼養(yǎng)；處理4：取同樣大小創(chuàng)傷、未創(chuàng)傷的健康斑點叉尾鮰，用6.5 g/L無菌生理鹽水浸泡2 h，為處理3的對照．試驗組和對照組分別放在水溫28 ℃的不同水池中飼養(yǎng)，觀察斑點叉尾鮰的發(fā)病情況，記錄魚的死亡數(shù)量及癥狀．

1.3.3 回歸感染試驗 選擇人工感染患病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似的腸、肝、腎等組織進行再分離，挑取與原來人工感染試驗形態(tài)特征一致的單個菌落，再次進行人工感染試驗，觀察斑點叉尾鮰發(fā)病情況，并記錄結(jié)果．

1.4 分離菌的鑒定

1.4.1 生理生化鑒定 將病原菌在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察菌落的形態(tài)特征，并進行革蘭氏染色．按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]、《伯杰細菌鑒定手冊》(第九版)[7]和中國科學院微生物研究所 《一般細菌常用鑒定方法》[8]中的方法進行生理生化性質(zhì)測定．另外，取單個菌落純化培養(yǎng)后用Bio Merieux Vitek全自動微生物分析系統(tǒng)進行細菌鑒定，該步驟由長沙市天地人微生物實驗室進行．

1.4.2 分子生物學鑒定 取1 mL培養(yǎng)好的菌液，用TIANGEN DNA試劑盒提取總DNA．抽提細菌的基因組DNA在8 g/L瓊脂糖凝膠電泳上觀察檢驗，并作為PCR擴增的模板．選用1對擴增細菌16S rDNA的通用引物，引物序列如下：上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′．PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：模板DNA 4 μL，上、下游引物各2 μL(引物濃度10 μmol/L)，2×PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O至50 μL混勻．PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共進行30個循環(huán)；最后72 ℃溫育10 min結(jié)束反應(yīng)．取5 μL 的反應(yīng)液用8 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下將目的條帶切下，用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化，純化后送至上海生工公司進行序列測定，將所得到的16S rDNA序列運用NCBI的BALST程序進行同源序列比對[9-10]．

2 結(jié)果與分析

病魚的自然發(fā)病癥狀：病魚主要表現(xiàn)為體表 ( 特別是腹部和下頜 ) 充血、出血(圖1a)，肛門紅腫( 圖1b)．病魚鰓絲腫脹發(fā)白，粘附大量黏液．腹部膨大( 圖1b)，解剖病魚腹腔內(nèi)充滿大量含血的腹水 ( 圖1c)，胃腸道粘膜充血、出血，胃腸道內(nèi)沒有食物，胃底部和幽門部粘膜充血、出血( 圖1c、d、e)．肝腫大，顏色變淡，有的呈土黃色，部分魚可見出血斑，質(zhì)地變脆，膽囊擴張，膽汁充盈；脾、腎腫大，淤血，部分病魚可見鰾和脂肪充血和出血( 圖1e)．

圖1 病魚自然發(fā)病癥狀

2.1 分離菌的培養(yǎng)特性

從發(fā)病癥狀典型的斑點叉尾鮰病魚的鰓、腸壁、肝、脾、腎等處通過分離、提純、重復(fù)回歸感染試驗得到3株菌FB1、FB2、FB3，3株菌在普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上都生長良好，形成表面濕潤光滑、邊緣整齊、中央微隆起、灰白色半透明的中等大小圓形菌落．

2.2 人工感染試驗

2.2.1 病毒感染試驗 在經(jīng)過濾膜過濾后的濾液的劃線培養(yǎng)試驗中，沒有發(fā)現(xiàn)細菌生長，證明濾液無菌．將過濾后無菌的濾液注射感染健康斑點叉尾鮰，未出現(xiàn)病癥和死亡，其結(jié)果表明了斑點叉尾鮰敗血癥不是由病毒引起的．

2.2.2 細菌感染試驗 見表1，腹腔注射FB1菌株的斑點叉尾鮰在9 d內(nèi)全部死亡，注射FB2、FB3菌株死亡現(xiàn)象不明顯；而對照組無任何癥狀和死亡現(xiàn)象．FB1實驗組體表潰爛，體內(nèi)各器官充血、出血，腹腔內(nèi)有腹水；FB2、FB3部分實驗魚腸壁開始變薄，繼續(xù)飼養(yǎng)20 d后，解剖實驗魚出現(xiàn)套腸癥狀.

表1 人工注射感染試驗結(jié)果

創(chuàng)傷浸浴感染FB1菌株的斑點叉尾鮰在9 d內(nèi)全部相繼死亡，見表2，F(xiàn)B2 、FB3死亡率均為20%；而未創(chuàng)傷浸泡感染FB1、FB2、FB3菌株的死亡率都低于創(chuàng)傷浸泡感染組，斑點叉尾鮰在9 d內(nèi)死亡率分別為：60%、0%、10%．對照組無任何癥狀和死亡現(xiàn)象．

表2 浸泡感染試驗結(jié)果

2.2.3 回歸感染試驗 在人工注射感染和人工浸泡感染試驗中出現(xiàn)與自然發(fā)病情況下相似癥狀的鮰魚的鰓、腸、肝、腎等組織處分別分離到與原病原菌一致的菌株，經(jīng)再次感染又可分離到FB1菌株，這說明FB1菌為斑點叉尾鮰細菌性敗血癥的致病菌．

2.3 分離菌的鑒定

2.3.1 生理生化特性鑒定 對分離到的3株菌FB1、FB2、FB3進行生理生化測定，結(jié)果見表3．由表3可見，3株菌都屬于革蘭氏陰性桿菌，F(xiàn)B1為兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌，極生單鞭毛，具運動力，無芽孢，無莢膜．能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖等產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，不發(fā)酵肌醇、木糖等，氧化酶、過氧化氫酶、DNA酶、酯酶、賴氨酸脫羧酶陽性，鳥氨酸脫羧酶、脲酶陰性，還原硝酸鹽，產(chǎn)H2S，胨化牛奶，液化明膠．經(jīng)湖南天地人生物有限公司Bio Merieux Vitek全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定FB1為嗜水氣單胞菌．FB2和FB3經(jīng)檢測鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌．專性需氧，非發(fā)酵型的革蘭氏陰性極生多鞭毛短桿菌．氧化酶陰性，過氧化氫酶、蛋白酶、脲酶、賴氨酸脫羧酶陽性，不產(chǎn)H2S，還原硝酸鹽，水解明膠和七葉苷．在氧化發(fā)酵試驗中除分解麥芽糖產(chǎn)酸明顯外，其余的都產(chǎn)酸緩慢或不產(chǎn)酸．

2.3.2 分子生物學鑒定 FB1的測序結(jié)果如下：

CCTCCATGAACTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCGTACAGAGGGCTGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGCGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAAATCAGAATGTTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGATAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGTTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCCTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCCAGTCCTA

大小為342 bp.FB1菌株16S rDNA序列的GenBank登錄號為HM161724．

FB2的測序結(jié)果如下：

CCTCTCATGGACTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTGCCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGTTGGATCACCTCCTAA

大小為345 bp.FB2菌株16S rDNA序列的GenBank登錄號為HM161726．

表3 分離菌的生理生化特征

注：“+”為陽性；“-”為陰性；⊕為產(chǎn)酸產(chǎn)氣．

FB3的測序結(jié)果如下：

CGTCTCATGGTCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTGCCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGTTGGATCACCTCCTAA

大小為345 bp.FB3菌株16S rDNA序列的GenBank登錄號為HM161725．

將這3株細菌的16S rDNA序列遞交NCBI進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)FB1的16S rDNA序列與GenBank database中AeromonashydrophiliaAF106602比對所得總分最高，具有較高的同源性(99%)，且兩個可變區(qū)域的序列完全一致[11]．FB2和FB3的16S rDNA序列與StenotrophomonasmaltrophiliaAJ293471 的序列有99%的相似性．這與Bio Merieux Vitek全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定的結(jié)果一致，確定FB1為嗜水氣單胞菌，F(xiàn)B2和FB3為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌．

3 討論

(1)在人工浸泡感染試驗中，創(chuàng)傷浸浴感染組死亡率明顯高于未創(chuàng)傷浸浴感染組，這可能是因為魚體體表存在大量的粘液，主要由多糖和蛋白質(zhì)組成，含有大量抵抗病原微生物入侵的非特異性免疫活性物質(zhì)，可以保護魚體不受病原體的侵害[12]．

(2)本研究對分離提純得到的FB1，F(xiàn)B2，F(xiàn)B3進行微分子生物學鑒定，結(jié)果表明FB1為嗜水氣單胞菌，F(xiàn)B2，F(xiàn)B3為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌． 嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是重要的人畜共患病的病原菌，同時也是危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一．它們可感染多種水生動物引起相應(yīng)的疾病，各種淡水魚都可感染[4,11]，本研究中分離得到的嗜水氣單胞菌FB1可引起叉尾鮰的肌肉及各器官組織的充血、出血與溶血等現(xiàn)象，而無套腸癥狀，這與蘇應(yīng)兵[13]等報道結(jié)果不一致，蘇應(yīng)兵[13]等報道嗜水氣單胞菌會引起叉尾鮰套腸癥狀，而作者用FB1注射感染叉尾鮰無此癥狀．

(3)用FB2,FB3注射感染叉尾鮰，20 d以后檢查存活的實驗用魚，有套腸癥或腸道壁變薄現(xiàn)象，但病魚無充血出血現(xiàn)象．實驗還在進行中，其結(jié)果將另文報道．

參考文獻：

[1] 楊先樂.特種水產(chǎn)動物疾病的診斷與防治[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[2] 錢 冬，陳月英.引起魚類暴發(fā)性流行病的嗜水氣單胞菌的血清型、毒力及溶血性[J]．微生物學報，1995，35(6)：460-464．

[3] 鄔國民，陳 慈，李恒頌，等.我國斑點叉尾鮰養(yǎng)殖現(xiàn)狀和前景展望[J].中山大學學報論叢,1998(4):75-79.

[4] 戰(zhàn)文斌.水產(chǎn)動物病害學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[5] 耿 毅，汪開毓，陳德芳，等．斑點叉尾鮰一株致病菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].微生物學報，2006，46(4)：649-652.

[6] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]．北京：科學出版社，2001.

[7] 布坎南.伯杰細菌鑒定手冊(第九版)[M]．中國科學院微生物研究所譯．北京：科學出版社，1994.

[8] 中國科學院微生物研究所細菌分類組．一般細菌常用鑒定方法[M]．北京：科學出版社，1978.

[9] THEODORE S，COENYE T，VANDAMME P.PCR-based assay for differentiation of pseudomonas species recovered from cystic fibrosis[J].J Clin Microbiol,2004，42：2074-2079.

[10] YUAN F，QU S P，CUI C S.A new strain of Eruinia carotovora subsp.Carotovora isolated from soft rotted Chinese cabbage[J].Acta Microbiol Sinica,2004(2)：136-140.

[11] 陸承平．致病性嗜水氣單胞菌及其所致魚病[J]．水產(chǎn)學報，1992，16(3)：225-227．

[12] HARRIS N B,ROGERS D G.Septicemia as sociated with stenotrophomonas maltophiliaina west African dwarf crocodile ( Osteolaemu stetraspis subsp.Tetraspis ) [J].J Vet Diagn Invest,2001,13(3): 255-258.

[13] 蘇應(yīng)兵.斑點叉尾鮰暴發(fā)性敗血癥的病原及免疫預(yù)防研究 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2006.