HPLC法測定試制卷煙及煙氣中6種中草藥活性成分的轉(zhuǎn)移率

劉 璐，趙 瑜，賀冬秀，譚新良，陳 波,楊華武

(1.湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析省部共建教育部重點實驗室，中國 長沙 410081；2.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，中國 長沙 410007)

煙草屬于茄科煙屬，是一種重要的經(jīng)濟作物．煙草中含有2000多種化學(xué)物質(zhì)，燃燒后產(chǎn)生的煙氣中更含多達(dá)5000種物質(zhì)，其中有大量對人體有害成分，如：尼古丁、焦油和煙堿等．吸食后會對人體器官如心臟、肺等產(chǎn)生不良后果．為減少卷煙中有害成分對人體相關(guān)損傷，煙草行業(yè)有部分企業(yè)嘗試將一些對人體有益的中草藥活性成分加入卷煙中，如：廣西中煙工業(yè)公司技術(shù)中心將羅漢果苷作為煙用添加劑來增加卷煙香氣量，降低煙氣干燥感[1]．目前，香煙及其燃燒后的煙氣中成分的檢驗通常采用氣相色譜法(GC)[2]、高效液相色譜法(HPLC)[1]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[3]．其中高效液相色譜法是在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，具有分析速度快、分離效能高、自動化等特點，應(yīng)用十分廣泛．湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司在卷煙中中草藥成分添加方面進(jìn)行了大量探索工作．其中，將試制卷煙(該試制卷煙經(jīng)過毒理學(xué)和臨床實驗證實可以緩解吸煙所致呼吸道疾病)中添加巖白菜素、黃芩苷、甘草苷等具有鎮(zhèn)咳祛痰、消炎降壓功效的中草藥活性成分．測定這6種成分在煙絲向其燃燒煙氣中的轉(zhuǎn)移率，檢驗燃吸過程中這些中草藥提取物的有效成分是否轉(zhuǎn)移到煙氣中，提供添加草本中藥提取物卷煙中的有效成分向煙氣中轉(zhuǎn)移的證據(jù)，并能對此類特制香煙的功效進(jìn)行初步評估．當(dāng)前的相關(guān)報道只對巖白菜素、黃芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和羅漢果苷中一種或者兩種成份[4-13]進(jìn)行檢測，尚未見卷煙中此六種物質(zhì)HPLC法同時檢測的相關(guān)報道．

本文建立了試制卷煙及其主流煙氣中這6種成分同時測定的HPLC法．為對此類試制卷煙及其燃燒后的煙氣中的中草藥活性成分的含量及轉(zhuǎn)移率的測定及其功效初步評估提供了方法基礎(chǔ)．

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SPD-20A高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津)；電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；離心機；粉碎機，快速渦旋儀．

甲醇、乙腈色譜純(美國天地公司)；磷酸，分析純(湖南師范大學(xué)試劑廠)；巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)(中國藥品生物制品檢定局提供)；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)(中國藥品生物制品檢定局提供)；甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%) (SHANGHAI TAUTO BIOTECH CO LTD (CHINA))；丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)和五味子素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)均由中國藥品生物制品檢定局提供；添加中藥成分的試制香煙與劍橋濾片(湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供)；水為雙蒸餾水．

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：HypersilC18-ODS 5 μm(200×4.6 mm)，流動相：A∶B=0.2%磷酸水∶乙腈，梯度洗脫(如表1所示)，檢測波長：205 nm，進(jìn)樣量：10 μL，流速：1 mL/min．

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制 單標(biāo)儲備液的配制：分別精密稱取適量的巖白菜素、黃芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和羅漢果苷標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，振蕩3 min，于5 mL容量瓶中定容，得到這6種待測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度分別為790，880，720，3 200，420，660 μg/mL．

混標(biāo)配制：分別取各單標(biāo)儲備液巖白菜素0.50 mL，黃芩苷0.50 mL，甘草苷0.50 mL，丹皮酚0.125 mL，五味子素0.50 mL，羅漢果苷2 mL于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至5 mL．得到混標(biāo)中各活性物質(zhì)的濃度分別為：79，88，72，80，42，264 μg/mL．

表1 梯度洗脫表

1.2.3 樣品前處理 取三根試制香煙，分別用粉碎機打粉稱重，各自溶解于100 mL 50%的甲醇中，放入超聲儀中超聲提取1 h．測定前用孔徑為0.45 μm的尼龍膜過濾．

取空白對照卷煙和加中藥提取物的實驗卷煙，在標(biāo)準(zhǔn)吸煙條件下分別在吸煙機上吸煙收集粒相成分，每片劍橋濾片各收集20支卷煙的煙氣．將劍橋濾片置于50 mL燒杯中，加入50%甲醇水溶液40 mL，超聲提取30 min，放冷，離心，上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，過0.45 μm有機濾膜后進(jìn)液相色譜分析．

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件以及提取方法優(yōu)化

為了獲得六種待測物最佳分離圖譜，本實驗對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化．本實驗考察了以下幾種不同流動相對待測物分離度的影響：甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)，甲醇-水-磷酸(22∶78∶0.1)，乙腈-水(23∶77)，乙腈-水(58∶42)，乙腈-0.2%磷酸水(58∶42)．實驗結(jié)果表明以上等度洗脫時，六種成分色譜峰分離效果不理想，繼續(xù)考察了0.2%磷酸水-甲醇，0.2%磷酸水-乙腈的梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)當(dāng)A∶B=0.2%磷酸水∶乙腈，進(jìn)行梯度洗脫時各待測物能獲得最佳分離效果．由于甲醇的截止波長為205 nm，乙腈的截止波長為190 nm，而羅漢果苷的最大吸收波長為205 nm，因此，選用乙腈作為流動相的有機相，能獲得較好分離效果．各待測物在優(yōu)化的色譜條件下的色譜圖如圖1所示，由圖1可知各待測物在優(yōu)化的實驗條件下獲得好的分離．

實驗中選用甲醇-水為樣品提取溶劑，同時考察了100%甲醇，50%甲醇，0%甲醇等不同比例甲醇對樣品中待測成分的萃取效果，對提取效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：50%甲醇超聲提取1 h能獲得最佳提取率，

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍及檢出限 分別取適量巖白菜素790 μg/mL，黃芩苷880 μg/mL，甘草苷720 μg/mL，丹皮酚3200 μg/mL，五味子素420 μg/mL，羅漢果苷660 μg/mL單標(biāo)貯備溶液，用50%甲醇稀釋搖勻，得一系列濃度的巖白菜素、黃芩苷，甘草苷，丹皮酚，五味子素，羅漢果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液．采用峰面積(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸分析，得到其線性回歸方程，檢出限由相應(yīng)于3倍儀器信/噪比的濃度值計算，結(jié)果見表2．

表2 6種物質(zhì)的回歸方程及檢出限

2.2.2 精密度 取6種物質(zhì)低，中，高三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2實驗方法分別進(jìn)行前處理以及HPLC測定平行測定5次．6種物質(zhì)日內(nèi)、日間精密度(RSD)(見表3)分別都小于4.0%和4.1%，表明日內(nèi)、日間精密度均滿足樣品分析的要求．

表3 6種物質(zhì)日內(nèi)、日間精密度

2.3 加標(biāo)回收率以及樣品分析

取6支已確定巖白菜素、黃芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和羅漢果苷含量的卷煙煙絲，分為6份，1支/份，在每份煙絲中分別添加不同量的巖白菜素、黃芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和羅漢果苷標(biāo)樣，然后采用本方法分別測定其含量，并根據(jù)原含量、加標(biāo)量和測定量計算回收率，結(jié)果這6種物質(zhì)在煙絲中的回收率分別為99.6%，98.5%，98.0%，100.3%，99.5%和97.6%．同樣，在已確定煙氣濾膜中巖白菜素、黃芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和羅漢果苷含量的濾膜上添加一定量的巖白菜素、黃芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和羅漢果苷標(biāo)樣，采用本方法測定煙氣濾膜中其回收率．結(jié)果表明這6種活性成分在煙氣濾膜中的回收率均在98.0%～100.3% 之間，說明新建方法準(zhǔn)確可靠．

運用此方法對試制香煙，煙氣濾膜(圖1)中巖白菜素、黃芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和羅漢果苷的含量進(jìn)行測定．

(1) 混標(biāo)色譜圖；(2) 試制香煙；(3) 劍橋濾片a.巖白菜素，b.甘草苷，c.羅漢果苷，d.黃芩苷，e.丹皮酚，f.五味子素圖1 混合標(biāo)樣及樣品色譜圖

由譜圖可得，這6種活性成分中，除甘草苷，黃芩苷，五味子素外，巖白菜素，丹皮酚及五味子素從香煙煙絲向煙氣中有所轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率分別為7.37%，15.26%和9.3%．這是因為巖白菜素，丹皮酚和五味子素的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，在煙絲燃燒過程轉(zhuǎn)移到了煙氣中，可在抽煙過程中被人體吸入，為特制卷煙中有效添加成分．而甘草苷，黃芩苷和五味子素在香煙點燃過程中由于高溫灼燒揮發(fā)掉或者生成另外的物質(zhì)，不能達(dá)到預(yù)期目的．

3 結(jié)論

本文成功地建立了一種準(zhǔn)確、快速地同時測定香煙及煙氣中的多組分高效液相色譜方法．并用于試制香煙以及煙氣中此6種中草藥活性成分轉(zhuǎn)移率的測定，結(jié)果滿意．

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉紹華，黃泰松，鄒克興，等.HPLC-ESI-MS法測定卷煙煙絲和煙氣中的羅漢果苷Ⅴ[J].煙草化學(xué)，2008(7)：38-41.

[2] 李中皓，邊照陽，魏甲欣，等.GC-MS法分析煙用內(nèi)襯紙中揮發(fā)性有機化合物[J].煙草化學(xué)，2010(1)：22-26.

[3] SAHA S，MISTRI R，RAY B C.Rapid and sensitive method for simultaneous determination of six carcinogenic aromatic amines in mainstream cigarette smoke by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2009，1216 (15)：3059-3063.

[4] 閆永紅，王 文，全楊娜.HPLC測定栽培甘草中甘草苷的含量[J].中國中藥雜志，2006，31 (1)：926-927.

[5] DHALWAL K，SHINDE V M，BIRADAR Y S，etal.Simultaneous quantification of bergenin，catechin，and gallic acid from Bergenia ciliata and Bergenia ligulata by using thin-layer chromatography[J].J Food Compos Anal，2008，21 (6)：496-500.

[6] 王育紅，孫永慧.HPLC法測定增光膠囊中五味子甲素的含量[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2007，35(4)：44-45.

[7] 王文忠，沈 浩，鄭 平.高效液相色譜法測定青果口服液中黃芩苷的含量[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，3 (10)：585-586.

[8] 趙白云，朱臻宇，王 彬，等.HPLC-DAD-TOF/MS法測定小柴胡湯中柴胡皂昔黃等昔和甘草酸的含量[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，28 (5)：527-530.

[9] 王光發(fā)，廖正根，梁新麗，等.HPLC測定巖白菜及四臣止咳顆粒中巖白菜素的含量[J].中成藥，2009，31 (11)：1799-1801.

[10] 呂士杰，蘆曉晶，李 妍，等.HPLC測定芩丹顆粒中黃芩苷和丹皮酚含量[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2010，31 (1)：1763-2995.

[11] 劉 波，鐘關(guān)萍，劉紅斌，等.采用高效液相色譜法測定巖白菜素口含片中巖白菜素和馬來酸氯本那敏的含量[J].云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，31 (S1)：313-317.

[12] 郭怡飚，胡曉煒，倪美文.RP-HPLC 法測定五子衍宗丸中五味子甲素、五味子乙素含量[J].中草藥，2002，33 (4)：317-318.

[13] LIN S J，TSENG H H，WEN K C，etal.Determination of gentiopicroside，mangiferin，palmatine，berberine，baicalin，wogonin and glycyrrhizin in the traditional Chinese medicinal preparation Sann-Joong-Kuey-Jian-Tang by high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，1996，730 (1-2)：17-23.