正交試驗(yàn)優(yōu)選房陵丹參水溶性成分半仿生-纖維素酶提取工藝Δ

蔡 華，楊光義，葉 方，黃良永，王 剛，郝新才（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰市 442000）

正交試驗(yàn)優(yōu)選房陵丹參水溶性成分半仿生-纖維素酶提取工藝Δ

蔡 華＊，楊光義#，葉 方，黃良永，王 剛，郝新才（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰市 442000）

目的：優(yōu)選半仿生-纖維素酶提取法提取房陵丹參水溶性成分最佳工藝條件。方法：以丹酚酸B得率、總酚酸得率和干浸膏收率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，以酶用量、酶解時(shí)間、料液比為考察因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為水解酶用量3mg·g-1，酶解時(shí)間2h，料液比1∶22。結(jié)論：所選工藝合理、可行，可為房陵丹參后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

正交試驗(yàn)；房陵丹參；半仿生-纖維素酶提取法；提取工藝

房陵丹參是湖北省房縣產(chǎn)唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。丹參水溶性成分有改善微循環(huán)、抑制血小板凝聚、減少心肌損傷及抗氧化等作用。2010年版《中國(guó)藥典》以丹酚酸B為對(duì)照品，用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)丹參水溶性成分進(jìn)行含量測(cè)定[1]。半仿生提取（SBE）法是在常壓、相對(duì)溫度較高的條件下，以不同pH值的水為溶劑進(jìn)行連續(xù)提取，得到含指標(biāo)成分較高“活性混合物”的一種新提取方法[2]。近年有學(xué)者提出，中藥經(jīng)口給藥進(jìn)入消化道后必須在各種酶的參與下藥效成分才能發(fā)揮作用，在SBE法基礎(chǔ)上，發(fā)展了半仿生-纖維素酶提?。⊿BEE）法，即選擇適宜的消化酶對(duì)中藥進(jìn)行處理，以破壞其細(xì)胞壁，再按SBE法在與人體體溫相近的溫度下進(jìn)行提取。該法既避免了高溫破壞藥效活性成分所致藥效降低，又體現(xiàn)了酶在藥效成分吸收中的作用，更能體現(xiàn)中藥的整體作用[3]。為了對(duì)房陵丹參進(jìn)行SBEE法的系統(tǒng)研究，筆者采用正交試驗(yàn)法，以丹酚酸B得率、總酚酸得率和干浸膏收率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，優(yōu)選房陵丹參水溶性成分SBEE提取法最佳工藝條件，以為后續(xù)對(duì)房陵丹參進(jìn)行質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UltiMateTM3000型HPLC儀，包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、chromeleon軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)戴安公司）；TU-1901型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AUW120D型電子天平（日本島津公司）；CQX25-06型超聲波震蕩器（上海必能信超聲有限公司）；pHS-25型數(shù)顯pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111562-200807）；纖維素酶（酶活力：30U·mg-1，北京索萊寶科技有限公司）；房陵丹參藥材采于湖北房縣神農(nóng)本草藥業(yè)公司房陵丹參GAP基地，由湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)系生藥學(xué)教研室主任陳吉炎教授鑒定為唇形科植物丹參S.miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，樣品打粉，過(guò)3號(hào)篩，備用；甲醇、乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期試驗(yàn)，丹參SBEE法最適pH為2.0、7.5、8.0。在飲片規(guī)格、溶媒、提取溫度、酶解溫度、濾過(guò)、濃縮等條件相同的前提下，選定水解酶用量（A）、酶解時(shí)間（B）和料液比（C）為考察因素，每個(gè)因素根據(jù)前期試驗(yàn)和參考文獻(xiàn)[3]各取3個(gè)水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

2.2 樣品溶液的制備

稱(chēng)取丹參藥材9份，每份6g，按表2中各條件進(jìn)行試驗(yàn)，第1次和第3次提取用加熱回流法（pH值分別為2.0、8.0；提取時(shí)間分別為 1.0、0.5h）；第2次改為加入纖維素酶（pH＝7.5），50℃水浴酶解提取。提取液用4層紗布加100目篩分別濾過(guò)，合并濾液，3000r·min-1離心25min，取上清液，濃縮至100mL，制得樣品溶液1～9號(hào)（每1mL相當(dāng)于原飲片0.06g）。

2.3 HPLC法測(cè)定丹酚酸B含量[1]

2.3.1 色譜條件色譜柱：DiamonsilTMC18（250mm×4.6mm，5μm），前加預(yù)柱（10mm×4.6mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：286nm；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取丹酚酸B對(duì)照品適量，加75%甲醇制成147μg·mL-1的丹酚酸B對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取樣品溶液5mL，置于蒸發(fā)皿中蒸干，加75%甲醇溶解至具塞錐形瓶中，超聲處理（功率：250W，頻率：40kHz）30min，放冷，定容至50mL容量瓶中，搖勻，以0.45μm濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液（每1mL相當(dāng)于原飲片0.006g）。

2.3.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 在上述色譜條件下，取丹酚酸B對(duì)照品溶液（147μg·mL-1）分別進(jìn)樣2.0、5.0、10.0、12.5、15.0、20.0μL，測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，丹酚酸B進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為Y＝19.44X－0.2597（r＝0.9998）。結(jié)果表明，丹酚酸B進(jìn)樣量在0.294～2.940μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取丹酚酸B對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果，RSD＝0.85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、1、2、4、8h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD＝1.49%（n＝5），表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定。結(jié)果，丹酚酸B的平均含量為31.66mg·g-1，RSD＝1.34%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取1號(hào)丹參供試品溶液（156μg·mL-1）9份，每份10mL，分別置于25mL容量瓶中，分成3組，各按80%、100%、120%的比例精密加入丹酚酸B對(duì)照品，加75%甲醇定容，搖勻，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為98.61%，RSD＝1.98%（n＝9）。

2.3.9 丹酚酸B的含量測(cè)定 取供試品溶液及丹酚酸B對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄丹酚酸B色譜峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，并按下式計(jì)算丹酚酸B得率：丹酚酸B得率＝丹酚酸B含量/0.006×100%。

2.4 分光光度法測(cè)定總酚酸含量[4]

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下溶液1.0mL，加75%甲醇定容至10mL量瓶中，即得對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密量取“2.3.3”項(xiàng)下溶液2.5mL，加75%甲醇定容至50mL量瓶中，即得供試品溶液。

2.4.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別取“2.4.1”項(xiàng)下丹酚酸B對(duì)照品溶液和“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液，以75%甲醇為空白，在200～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果，對(duì)照品溶液和供試品溶液均在285nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇285nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液（14.70μg·mL-1）1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別置于10mL量瓶中，加75%甲醇定容，以相應(yīng)溶劑為空白，于285nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以丹酚酸B檢測(cè)濃度（c，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為A＝0.0212c－0.0063（r＝0.9997）。結(jié)果表明，丹酚酸B檢測(cè)濃度在1.47～14.70μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，以溶劑為空白，于285nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)6次。結(jié)果，RSD＝0.23%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、6h在285nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，RSD＝0.37%（n＝5），表明供試品溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，于285nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，丹酚酸B的平均含量70.56mg·g-1，RSD＝0.35%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取“2.4.2”中1號(hào)丹參供試品溶液（19.8μg·mL-1）9份，每份5mL，分別置于10mL容量瓶中，分成3組，各按80%、100%、120%的比例精密加入丹酚酸B對(duì)照品，加75%甲醇定容，搖勻，于285nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為97.36%，RSD＝1.23%（n＝9）。

2.4.9 樣品中總酚酸的含量測(cè)定 取“2.4.1”、“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液及對(duì)照品溶液，于285nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總酚酸含量，并按下式計(jì)算總酚酸得率：總酚酸得率＝總酚酸含量/0.0003×100%。

2.5 干浸膏得率的測(cè)定

精密量取各樣品溶液25mL，置于已烘干至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃烘3h，置于干燥器內(nèi)30min，稱(chēng)重，并按下式計(jì)算干浸膏收率：干浸膏收率＝干浸膏重量/1.5×100%。

2.6 試驗(yàn)結(jié)果

以丹酚酸B得率、總酚酸得率、干浸膏收率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)。為消除各指標(biāo)單位和量綱的不同[5]，以及各指標(biāo)變量范圍懸殊所造成的影響，將各指標(biāo)數(shù)據(jù)按公式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（式中，X’ij為標(biāo)準(zhǔn)化的值；Xij為樣品液i中成分j的含量；Xj為各種樣品液i中成分j的平均值；Sj為成分的標(biāo)準(zhǔn)偏差），再根據(jù)各指標(biāo)在工藝選擇中的主次，給予不同的加權(quán)系數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)化后的值加權(quán)后求和即得綜合評(píng)分（Y）：Y＝丹酚酸B得率標(biāo)準(zhǔn)化值×6+總酚酸得率標(biāo)準(zhǔn)化值×3+干浸膏收率標(biāo)準(zhǔn)化值×1）。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表2、表3可知，料液比對(duì)丹參水溶性成分提取量的影響最大，各因素影響大小次序?yàn)镃＞B＞A。最佳的提取工藝條件是A2B3C3，即水解酶用量3mg·g-1，酶解時(shí)間2h，料液1∶22。

2.7 工藝驗(yàn)證

按優(yōu)化的SBEE法工藝條件，對(duì)房陵丹參進(jìn)行提取，并按上述方法測(cè)定丹酚酸B得率、總酚酸得率和干浸膏收率。結(jié)果，各指標(biāo)值與正交試驗(yàn)結(jié)果比較，均處于較高水平，表明優(yōu)選工藝合理、可行。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal design

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 4Results of Verification test（n＝3）

3 討論

植物細(xì)胞壁以纖維素為主，加入纖維素酶能使丹參藥材細(xì)胞壁纖維素的苷鍵斷裂而破碎，有利于內(nèi)容物的溶出，提高提取效率。通過(guò)前期對(duì)水加熱回流法、SBE法、α-淀粉酶法、纖維素酶法、半仿生-α-淀粉酶法、SBEE法等不同提取方法的比較，發(fā)現(xiàn)SBEE法提取效果最好。

纖維素酶的最適pH值為中性偏堿，故本試驗(yàn)選在第2次提取時(shí)進(jìn)行酶解反應(yīng)，以免在酸性條件下降低酶的活性[6]，使酶解作用達(dá)到最佳效果；第1次回流提取使藥材細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得疏松，也有利于水解酶充分發(fā)揮作用。

丹參水溶性酚酸類(lèi)成分中丹參素、原兒茶醛[7]與丹酚酸B等均在（280±5）nm波長(zhǎng)左右有較強(qiáng)吸收，因此根據(jù)吸收值的加和性特點(diǎn)，在285nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度能反應(yīng)總酚酸多種成分的含量。而丹酚酸B是丹參水溶性酚酸類(lèi)成分中活性最強(qiáng)、含量最高的成分[8]，以丹酚酸B作為對(duì)照品測(cè)定總酚酸的吸光度，可以用作總酚酸的含量測(cè)定方法，借以考察藥材提取方法整體效果，具有科學(xué)性和可行性。

房陵丹參中水溶性成分在長(zhǎng)時(shí)間高溫下易分解，SBEE法使用接近體內(nèi)環(huán)境的酶解溫度，可防止有效成分分解，提高了提取效率。

纖維素酶使細(xì)胞壁分解為易溶解的小分子二聚糖、葡萄糖等，說(shuō)明酶解法在提高有效成分提取率的同時(shí)，其雜質(zhì)含量可能同樣較高，除掉雜質(zhì)的方法和提取物的藥效作用是否優(yōu)于常規(guī)提取法，還有待于進(jìn)一步研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：70

[2] 張兆旺，孫秀梅.關(guān)于中藥藥劑現(xiàn)代化的思考[J].中成藥，2001，23（11）：843.

[3] 宋宏新，劉 靜，張彥娟.半仿生酶法提取三七皂苷工藝研究[J].中草藥，2009，40（6）：905.

[4] 鄭勝?lài)?guó)，郭 俊.分光光度法測(cè)定注射用丹參川芎嗪中丹參總酚酸的含量[J].中藥研究與信息，2005，7（11）：16.

[5] 袁小紅.蓮子心4種提取方法的比較研究[J].中國(guó)藥房，2006，17（8）：637.

[6] 王 蕙，付 燕，朗久義，等.酶法及半仿生提取銀杏黃酮的工藝研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（2）：146.

[7] 夏苗芬，周雙林.紫外分光光度法測(cè)定香丹注射液中水溶性酚和酚酸的總含量[J].科技通報(bào)，2004，20（11）：549.

[8] 趙淑娟，章國(guó)瑛，劉 滌，等.丹參水溶性酚酸類(lèi)化合物藥理及生物合成途徑研究進(jìn)展[J].中草藥，2004，35（3）：341.

Optimization of the Extraction Technology of Semi-bionic Enzyme from Water-soluble Component of Salvia miltiorrhiza of Fangling by Orthogonal Test

CAI Hua，YANG Guang-yi，YE Fang，HUANG Liang-yong，WANG Gang，HAO Xin-cai（Taihe Hospital Affiliated to Hubei Medical University，Shiyan 442000，China）

OBJECTIVE：To optimize the semi-bionic enzyme extraction technology of water-soluble component of Salvia miltiorrhiza of Fangling.METHODS：The extraction technology of S.miltiorrhiza was optimized by orthogonal design using the field of salvianolic acid B，total phenolic acid and dry extract as index and the amount of enzyme，enzymolysis duration and ratio of liquid to material as factors.RESULTS：Optimal extraction condition were as follows：hydrolase of 3mg·g-1，enzymolysis duration of 2h，ratio of liquid to material of 1∶22.CONCLUSION：The optimized extraction condition is reasonable and practical，and provides theoretic basis for further study of S.miltiorrhiza of Fangling.

Orthogonal test；Salvia miltiorrhiza of FangLing；Semi-bionic enzyme extraction；Extraction technology

R284.2；R943

A

1001-0408（2011）03-0222-03

Δ湖北省教育廳高校產(chǎn)學(xué)研合作資助項(xiàng)目（CXY2009B040）

＊主管藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話(huà)：0719-8801197。E-mail：tsai1094@sina.com

#通訊作者：主管藥師，博士。研究方向：中藥資源開(kāi)發(fā)和新藥研發(fā)。電話(huà)：0719-8801393。E-mail：ygy996@163.com

2010-04-12

2010-06-28）