高速逆流色譜分離制備甘草中的甘草苷和芒柄花苷

袁延強(qiáng)，王祖林，劉秀河，韓利文，劉可春*

1山東省科學(xué)院生物研究所，濟(jì)南250014;2山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，濟(jì)南250353

高速逆流色譜分離制備甘草中的甘草苷和芒柄花苷

袁延強(qiáng)1，王祖林2，劉秀河2，韓利文1，劉可春1*

1山東省科學(xué)院生物研究所，濟(jì)南250014;2山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，濟(jì)南250353

應(yīng)用高速逆流色譜分離制備甘草中的甘草苷和芒柄花苷。將甘草乙酸乙酯提取物經(jīng)聚酰胺柱粗分后，30%乙醇洗脫物用高速逆流色譜進(jìn)一步分離，所用兩相溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-水(5∶5，v/v)，轉(zhuǎn)速850 rpm，流速2.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，從50 mg30%乙醇洗脫物中得到甘草苷8.7 mg、芒柄花苷4.2 mg，純度分別為99.5%和97.3%。所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振譜(NMR)鑒定。利用該方法可以對(duì)甘草中的甘草苷和芒柄花苷進(jìn)行快速的分離和純化。

高速逆流色譜;甘草;甘草苷;芒柄花苷

甘草為豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草G.inflata Bat.或光果甘草G.glabra L.的干燥根及根莖，有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳、緩急止痛，調(diào)和諸藥等功效［1］。甘草中的黃酮類化合物具有較強(qiáng)的生物活性，近年發(fā)現(xiàn)該類化合物有抗氧化、抗炎、抗HlV、抗腫瘤等多種藥理作用［2-5］。甘草苷和芒柄花苷是甘草的主要活性成分，其中甘草苷具有抗炎、抗皮膚腫瘤、祛除皮膚色斑和抗抑郁的作用［6，7］，芒柄花苷具有神經(jīng)保護(hù)和抗氧化的作用［8］。因此，為了對(duì)甘草活性成分進(jìn)行更深層次的藥理藥效研究，建立一種快速有效的分離制備方法具有重要意義。

高速逆流色譜(HSCCC)是近年來發(fā)展起來的一種液-液分配色譜新技術(shù)，其特點(diǎn)是被分離物質(zhì)在兩相液體中進(jìn)行分配，不需要任何固相載體，克服了固相載體對(duì)樣品吸附、損失、污染等缺點(diǎn)，具有適應(yīng)面廣、高效、快速、制備量大、費(fèi)用低等特點(diǎn)，因而在天然產(chǎn)物的分離純化領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前，利用高速逆流色譜已從甘草中成功分離到多種黃酮類化合物，如甘草黃酮醇(licoflavonol)、甘草素(liquiritigenin)、芒柄花素(formononetin)、甘草異黃酮甲(licoisoflavone A)、異甘草素(isoliquiritigenin)、甘草查兒酮甲(licochalcone A)等［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)先用聚酰胺樹脂對(duì)甘草乙酸乙酯提取物進(jìn)行處理，然后采用HSCCC法對(duì)其進(jìn)一步分離，得到了純度均大于97%的甘草苷和芒柄花苷，為從甘草中制備甘草苷和芒柄花苷提供了一種新方法。

1 材料

甘草粗提物制備及HSCCC分離用溶劑(石油醚、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙醇等)均為分析純(天津廣成化學(xué)試劑公司);HPLC分析用甲醇為色譜純(天津科密歐化學(xué)試劑公司);水為超純水;聚酰胺樹脂(80～100目，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)。

甘草購于濟(jì)南建聯(lián)中藥店，產(chǎn)地內(nèi)蒙古，由宋廣運(yùn)研究員鑒定。

TBE-300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司);HITACHI L-2000高效液相色譜儀(日本日立公司);HX-1050恒溫器(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);色譜柱:Apollo C18(5 μm，250 mm× 4.6 mm i.d.)(美國Alltech公司);INOVA-600型核磁共振儀(美國Varian公司)。

2 方法

2.1 樣品的預(yù)處理

2.1.1 甘草乙酸乙酯浸膏的制備

稱取1 kg甘草，干燥，粉碎至80目粒徑，以6倍質(zhì)量的70%乙醇水溶液加熱回流提取3次，減壓回收乙醇后，將浸膏溶于3 L熱水中，先用等體積的石油醚萃取5次，再用等體積的乙酸乙酯萃取5次，將乙酸乙酯萃取物減壓蒸餾，得30 g乙酸乙酯浸膏。

2.1.2 聚酰胺層析柱分離

將上述乙酸乙酯浸膏用少量乙醇溶解，加入2倍重量的聚酰胺樹脂，攪拌均勻后加入已處理好的聚酰胺(300 g)柱(5 cm×100 cm)上，依次用蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，每個(gè)梯度分別用5倍柱體積溶液沖洗，流速0.3 BV/h。將30%乙醇洗脫物濃縮干燥后得4.26 g樣品，置于冰箱中備用。

2.2 HPLC分析條件

色譜柱:Apollo C18(5 μm，250 mm×4.6 mm i.d.);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流動(dòng)相:甲醇-0.5%乙酸，以0～50 min甲醇從20%到100%進(jìn)行梯度洗脫;流速:1 mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20 μL。

2.3 兩相溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的制備

HSCCC溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯-水(5∶5，v/v)，按比例將兩種溶劑加入分液漏斗中，振蕩使溶液充分混合，靜置平衡后分得上相和下相，分別超聲脫氣15 min以備用。稱取約50 mg甘草預(yù)處理樣品，加入溶劑系統(tǒng)的上、下相各10 mL，振蕩使之溶解，以備HSCCC進(jìn)樣。

2.4 HSCCC分離過程

以10 mL/min將乙酸乙酯-水(5∶5，v/v)的上相(固定相)泵入HSCCC螺旋管，待螺旋管完全充滿固定相后，開啟HSCCC主機(jī)，旋轉(zhuǎn)方向?yàn)轫槙r(shí)針，使轉(zhuǎn)速逐漸增加到850 rpm，同時(shí)以2.0 mL/min的流速泵入下相(流動(dòng)相)。當(dāng)流動(dòng)相從螺旋管尾端流出時(shí)，系統(tǒng)即達(dá)到動(dòng)力學(xué)平衡，此時(shí)將“2.3”制備的樣品溶液注入樣品環(huán)。紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，根據(jù)色譜圖收集各流分。

3 結(jié)果與分析

3.1 甘草預(yù)處理樣品的HPLC分析

采用“2.2”節(jié)的色譜條件，對(duì)甘草預(yù)處理樣品進(jìn)行分離，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在該條件下，樣品可以得到很好的分離效果，A和B為254 nm檢測(cè)到的主要色譜峰。

圖1 甘草預(yù)處理樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of pretreatment samples of Glycyrrhiza uralensis

3.2 高速逆流色譜分離條件的優(yōu)化

溶劑系統(tǒng)的選擇是高速逆流色譜分離的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不同的溶劑系統(tǒng)會(huì)對(duì)不同的成分產(chǎn)生不同的溶解分配能力，從而造成分配系數(shù)的差異，對(duì)分離效果產(chǎn)生顯著的影響。通常對(duì)HSCCC最合適的分配系數(shù)K值范圍是0.5～5。如果分配系數(shù)K過小，出峰時(shí)間太快，峰之間的分離度較差;而分配系數(shù)K過大時(shí)出峰時(shí)間太長(zhǎng)且峰形變寬。根據(jù)待分離組分的極性，本實(shí)驗(yàn)考察了乙酸乙酯-水系統(tǒng)，通過加入正己烷、甲醇、正丁醇等溶劑調(diào)整成分A和B的分配系數(shù)(依據(jù)文獻(xiàn)［12］計(jì)算分配系數(shù))，結(jié)果見表1。

表1 成分A和B在不同兩相溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)Table 1 The K-values of compound A and B in different twophase solvent systems

正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水( 1∶5∶1∶5，v / v ) 0.1 4 0.4 1乙酸乙酯-正丁醇-水( 5∶1∶5，v / v ) 2.3 8 5.9 7乙酸乙酯-水( 5∶5，v / v ) 0.7 1 2.1 3

在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶5∶5，v/v)系統(tǒng)中成分A和B的分配系數(shù)太小，通過降低正己烷、甲醇的比例，增大正丁醇的比例使KA、KB增大。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，成分A、B在乙酸乙酯-水(5∶5，v/v)系統(tǒng)的分配系數(shù)較合適。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行了考察，由于該樣品在乙酸乙酯-水(5∶5，v/v)系統(tǒng)中的溶解性較差，若進(jìn)樣量太大，樣品不溶解，易導(dǎo)致固定相流失。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇進(jìn)樣量為50 mg。

3.3 HSCCC分離制備的結(jié)果

選擇乙酸乙酯-水(5∶5，v/v)為溶劑系統(tǒng)，采用“2.4”的條件進(jìn)行HSCCC分離，在此條件下，固定相保留率為53%，分離時(shí)間4 h，HSCCC圖見圖2。根據(jù)HSCCC圖收集成分A和B，減壓干燥得A (8.7 mg)和B(4.2 mg)，將成分A和B通過HPLC檢測(cè)(見圖3)，面積歸一化確定其純度分別為99.5%和97.3%。

3.4 成分A、B的結(jié)構(gòu)鑒定

A(白色粉末)1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.65(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.45(2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6')，7.07(2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5')，6.51(1H，dd，J=9.0，1.8 Hz，H-6)，6.35(1H，d，J= 1.8 Hz，H-8)，5.53(1H，dd，J=12.6 Hz，2.4，H-2)，4.89(1H，d，J=7.2 Hz，glc-H-1)，3.14(1H，dd，J= 16.2，12.6 Hz，H-3-trans)，2.67(1H，dd，J=16.2，2.4 Hz，H-3-cis)。13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ: 79.34(C-2)，43.84(C-3)，190.61(C-4)，129.09(C-5)，111.24(C-6)，165.32(C-7)，103.26(C-8)，163.73(C-9)，114.22(C-10)，133.01(C-1')，128.69 (C-2'，6')，116.83(C-3'，5')，158.12(C-4')，100.95 (glc-C-1)，73.88(glc-C-2)，77.72(glc-C-3)，70.36 (glc-C-4)，77.28(glc-C-5)，61.35(glc-C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道一致，故鑒定為甘草苷。

B(白色粉末)1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 8.45(1H，s，H-2)，8.06(1H，d，J=9.0 Hz，H-5)，7.54(2H，d，J=9.0 Hz，H-2'，6')，7.25(1H，d，J= 1.8Hz，H-8)，7.15(1H，dd，J=9.0 Hz，1.8 Hz，H-6)，7.0(2H，d，J=9.0 Hz，H-3'，5')，5.11(1H，d，J =7.8Hz，glc-H-1)，3.79(3H，s，-OCH3)。13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ:154.34(C-2)，124.04(C-3)，175.34(C-4)，127.63(C-5)，116.31(C-6)，162.12(C-7)，104.07(C-8)，157.72(C-9)，119.12 (C-10)，124.67(C-1')，130.76(C-2'，6')，114.30 (C-3'，5')，159.70(C-4')，100.64(glc-C-1)，73.79 (glc-C-2)，77.14(glc-C-3)，70.29(glc-C-4)，77.88 (glc-C-5)，61.30(glc-C-6)，55.83(-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報(bào)道一致，故鑒定為芒柄花苷。

4 討論

本文采用聚酰胺樹脂和高速逆流色譜相結(jié)合的方法分離純化甘草中的黃酮類成分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過兩種方法的聯(lián)用可以分離制備高純度的甘草苷和芒柄花苷。本文的研究為甘草中黃酮類成分的分離提供了一條新的技術(shù)路線，為甘草黃酮成分的進(jìn)一步藥理活性研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Preparative Separation of Liquiritin and Ononin from Glycyrrhiza uralensis by High-speed Counter-current Chromatography

YUAN Yan-qiang1，WANG Zu-lin2，LIU Xiu-he2，HAN Li-wen1，LIU Ke-chun1*1Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China;2College of Food＆Bioengineering，Shandong Institute of Light Industry，Jinan 250353，China

High-speed counter-current chromatography(HSCCC)was used to isolate and produce liquiritin and ononin from Glycyrrhiza uralensis.Firstly，the ethyl acetate extract of G.uralensis was purified by polyamide column chromatography，and then，the samples eluted by 30%ethanol-water were further purified by HSCCC.By using a two-phase solvent system composed of ethyl acetate-water(5∶5，v/v)，8.7 mg of liquiritin and 4.2 mg of ononin were isolated from 50 mg samples with purities of 99.5%and 97.3%under the conditions of the flow rate of 2.0 mL/min，the rotational speed of 850 r/min and the detection wavelength of 254 nm.The structures of the obtained products were analyzed by NMR.The results indicated that HSCCC was an efficient method for isolation and purification of liquiritin and ononin.

high-speed counter-current chromatography;Glycyrrhiza uralensis;liquiritin;ononin

1001-6880(2011)06-1148-04

2010-01-26 接受日期:2010-06-12

山東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2006GG3202038)

*通訊作者 Tel:86-531-82605352;E-mail:hliukch@keylab.net

R284.2

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