高效液相法與硫酸-蒽酮法測定豬苓多糖含量比較

張國偉，李彩霞，王艷峰，黃 羽，蘇芝軍，鄭 芳，曾 星*

1河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，保定071002;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510006; 3中國醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都610051;4陜西省府谷縣人民醫(yī)院，府谷719400

高效液相法與硫酸-蒽酮法測定豬苓多糖含量比較

張國偉1，李彩霞2，王艷峰3，黃 羽2，蘇芝軍4，鄭 芳2，曾 星2*

1河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，保定071002;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510006;3中國醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都610051;4陜西省府谷縣人民醫(yī)院，府谷719400

本研究目的是比較高效液相法與硫酸-蒽酮法在測定豬苓多糖含量上的差異。為此，研究采用水提醇沉、Sevag法除蛋白、透析和冷凍干燥制備相對純化的豬苓多糖，通過凝膠滲透色譜及高效液相法對豬苓多糖的相對分子量分布、組成及含量進(jìn)行研究，用硫酸-蒽酮分光光度法測定豬苓顆粒中豬苓多糖的含量。結(jié)果顯示，豬苓多糖數(shù)均相對分子質(zhì)量為48，232，重均相對分子質(zhì)量為117，506，分子范圍2.44，可能由海藻糖和葡萄糖組成，其含量分別為6.05%和62.28%。硫酸-蒽酮法側(cè)的豬苓多糖含量為87.9%。對于豬苓多糖含量測定，高效液相法優(yōu)于硫酸-蒽酮法。

豬苓多糖;高效液相法;硫酸-蒽酮法

藥用豬苓為多孔菌科多孔菌屬真菌豬苓(Polyporus Umbellatus(Pers.)Fries)的干燥菌核，為利水滲濕常用中藥。豬苓多糖(PPS，polyporus polysaccharide，水溶性多聚糖聚6-支鏈β-1，3-葡聚糖)為豬苓中主要成分，可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［1］，是一種極有潛力的免疫增強(qiáng)劑［2］。前期研究證實PPS對膀胱癌細(xì)胞有抑制作用，體外應(yīng)用于小鼠膀胱癌細(xì)胞T739，可通過降低IKBKB基因表達(dá)激活Toll信號通路相關(guān)基因抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖［3，4］。本實驗采用水提醇沉法制備豬苓粗多糖，通過Sevag法除蛋白后再次醇沉并通過透析和冷凍干燥制備相對純化的豬苓多糖，通過凝膠滲透色譜(GPC，gel permeation chromatography)及HPLC法測定其相對分子量分布、組成及含量。為簡化豬苓多糖的測量方法，實驗中還使用硫酸-蒽酮分光光度法測豬苓顆粒中豬苓多糖的含量，并與HPLC法測定結(jié)果比較研究，探討了有關(guān)實驗條件對測定結(jié)果的影響。

1 材料、試劑與儀器

豬苓顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司，批號，0811174)，葡萄糖，棉籽糖，海藻糖(sigma)，蒽酮(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(Merck公司，HPLC級)，實驗用水為Millipore超純水，其它試劑均為分析純。

UV-2650紫外分光光度計(日本島津)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV 10basic V，德國IKA公司)，冷凍干燥儀(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9146A型，上海精密實驗設(shè)備有限公司)，分析天平(AL104-LC，METTER TOLEDO公司)，超低溫冰箱(U725，美國NBS公司)，離心機(jī)(LD25-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，Agilent 1100高效液相色譜儀。

2 方法

2.1 豬苓多糖的提取

豬苓顆粒(0.5 g/10 g生藥)100 g，溶于2000 mL水中，100℃水浴1.5 h，抽濾，濾渣再重復(fù)提取1次，合并2次濾液，紗布過濾，3000 r/min離心10 mim，上清減壓濃縮至合適體積，加95%乙醇，使其濃度達(dá)到80%，攪拌，置4℃箱中過夜，離心分離收集沉淀得粗多糖，抽濾液減壓濃縮。將所得粗多糖冷凍干燥，粗多糖溶于純水中，Sevage法(氯仿:正丁醇=5∶1，先加入氯仿，調(diào)pH=4-5，隨后加入正丁醇)，混合物劇烈震蕩20 min，蛋白質(zhì)變性成膠狀，存在于水相和溶劑相的交界面上，3000 r/min離心10 mim，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白，重復(fù)5次。將溶液減壓濃縮后加入95%乙醇使溶液中使醇濃度為80%，置4℃箱中過夜，3000 r/min離心10 mim，冷凍干燥，得除蛋白多糖。將所得除蛋白多糖溶于純水，緩慢溶解，用玻棒攪拌，使不溶物緩慢溶解，記錄溶液體積。用3%稀氨水調(diào)節(jié)溶液PH值為8～9，將多糖粗品水溶液加入500 mL三頸燒瓶，向燒瓶中加入1/3體積的30%H2O2，在50℃條件下攪拌2.5 h，溶液顏色逐漸變淺，待溶液冷卻，加入95%乙醇使溶液中醇濃度為80%，置4℃箱中過夜，離心收集沉淀，將沉淀溶于適量純水中，用流水透析48 h，純水24 h(每6 h換水一次)，透析后溶液加95%乙醇使醇濃度為80%，置4℃箱中過夜，離心收集沉淀，沉淀冷凍干燥，得豬苓多糖。

2.2 GPC法測定豬苓多糖相對分子質(zhì)量分布

2.2.1 GPC條件

色譜柱，TSK-GEL G3000SWXL，300 mm×7.8 mm，柱溫35℃;流動相，0.05 M NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH=6.7，加0.05%NaN3);體積流量，0.5 mL/min;示差折光檢測器，恒溫35℃;進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 GPC校正曲線的建立

取已知相對分子質(zhì)量為738、5800、1.22×104，4.8×104，1.0×105，1.86×105，3.8×105，8.35× 105的多糖標(biāo)樣，用0.05 M NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(PH=6.7，加0.05%NaN3)溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，進(jìn)行GPC分析。以多糖標(biāo)樣的保留時間為橫坐標(biāo)，多糖相對分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)做GPC普適校正曲線。

2.2.3 樣品分析

取一定量豬苓多糖樣品，用0.05 M NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH=6.7，加0.05%NaN3)溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，進(jìn)行GPC分析。根據(jù)樣品出峰時間在校正曲線上求得多糖峰的平均相對分子質(zhì)量及分布。

2.3 HPLC法測定豬苓多糖組成及其含量

2.3.1 豬苓多糖的水解

取200 mg純化豬苓多糖，加入2 M H2SO438 mL加熱回流6h，冷卻，用飽和Ba(OH)2溶液中和至中性，過濾，清液濃縮定容至10 mL，進(jìn)行HPLC分析。

2.3.2 HPLC條件

色譜柱為Kromasil NH2(250 mm×4.6 mm)，柱溫45℃;流動相:乙腈-水(80∶20);體積流量:1.2 mL/min;示差折光檢測器，恒溫45℃;進(jìn)樣體積10 μL。

2.4 硫酸-蒽酮法測定豬苓多糖含量

2.4.1 蒽酮試劑

溶解0.2 g蒽酮于濃硫酸中(A.R.)，當(dāng)日配制使用。

2.4.2 測試條件的選擇

將精密稱取干燥至恒重的葡萄糖50.0 mg置于50 mL量瓶中，純水溶解并定容至刻度，搖勻，制得1.0 g/L葡萄糖貯備液。取葡萄糖貯備液以純化水稀釋成200 mg/L制得葡萄糖稀釋液。吸取葡萄糖稀釋液2.0 mL，置于具塞試管中，加入2 g/L蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，后放入熱水浴中，管口加蓋玻璃塞，以防蒸發(fā)，準(zhǔn)確煮沸10 min取出，自來水冷卻。室溫放置10 min，以試劑空白為參比，在400～800 nm波長范圍進(jìn)行掃描。將精密稱量干燥至恒重的豬苓多糖樣品0.5 g，加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，精密移取25.0 mL于500 mL量瓶中，加水定容，得豬苓多糖貯備液。取2.0 mL豬苓多糖貯備液，置于10 mL具塞試管中，按上法操作，在460 nm～800 nm波長范圍進(jìn)行掃描［5］。

2.4.3 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確移取葡萄糖貯備液1，2，3，5，8，10 mL，分別置于50 mL量瓶中，加水至刻度(相當(dāng)于20，40，60，80，100，160，200 mg/L)。分別取上述溶液2.00 mL置10 mL具塞試管中，加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起放入熱水浴中，管口加蓋玻璃塞，以防蒸發(fā)，準(zhǔn)確煮沸10 min取出，自來水冷卻。室溫放置10 min，以試劑空白為參比，在610 nm波長處測定吸收度。得到每1 mL含葡萄糖20～200 μg范圍內(nèi)葡萄糖量和吸收度呈良好的線性關(guān)系，求回歸方程。

2.4.4 精密度試驗

平行取7份葡萄糖稀釋液和豬苓多糖供試液，蒽酮-硫酸法顯色后測定吸光度，計算結(jié)果。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗

精密量取葡萄糖稀釋液和豬苓多糖的供試液，置于具塞試管中，各加入加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，按“2.4.2”項下操作，于室溫自然光下放置2 h，每10 min測定一次，求A值在120 min內(nèi)穩(wěn)定性。

2.4.6 重復(fù)性考察

取同一批樣品，按粗多糖貯備液的制備方法平行制備6份，按上述方法進(jìn)行含量測定，分別測定吸光度，計算濃度，考察重復(fù)性。

2.4.7 回收率實驗

分別精密稱取5.0 mg葡萄糖，配制成50 mg/L溶液。向50 mL量瓶中分別精密量取5 mL豬苓多糖貯備液5份，同時，分別精密加入1.0 mL葡萄糖溶液，后用純化水稀釋至50 mL。按“2.4.2”項下操作進(jìn)行含量測定，計算回收率。回收率公式:(最終測得量-原樣品已知量)/對照品加入量×100%。

2.4.8 樣品的測定

準(zhǔn)確移取豬苓多糖供試液1.0 mL，按“2.4.3”方法顯色，測定吸光度，以下列公式計算各樣品多糖的含量(mg/g):多糖的含量=(C×D)/(w×E)式中:C為測試液中多糖濃度(g/L)，D為供試液的稀釋因子，E為稱量多糖樣品占提取總多糖樣品比例因子，w為樣品質(zhì)量(g)。

3 結(jié)果

3.1 豬苓多糖相對分子質(zhì)量分布

豬苓多糖數(shù)均相對分子質(zhì)量為48232，重均相對分子質(zhì)量為117506，分子范圍為2.44［圖1］。

圖1 豬苓多糖GPC色譜圖Fig.1 The GPC chromatogram of polyporus polysaccharide from Polyporus Umbellatus(Pers.)Fries.

3.2 豬苓多糖組成及含量

豬苓多糖水解后用HPLC分析其單糖組成，并與單糖標(biāo)樣進(jìn)行對照，豬苓多糖可能由海藻糖和葡萄糖組成，其含量分別為6.05%和62.28%［圖2］。

圖2 A葡萄糖HPLC色譜圖;B海藻糖HPLC色譜圖;C豬苓多糖HPLC色譜圖Fig. A.The HPLC chromatogram of glucose;B.The HPLC chromatogram of trehalose;C.The HPLC Chromatogram of polyporus polysaccharide

3.3 硫酸-蒽酮法測定豬苓多糖含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.0039x-0.0163，R2= 0.9987;葡萄糖與豬苓多糖的精密度RSD分別為2.94%和3.03%;120 min內(nèi)，葡萄糖和豬苓多糖穩(wěn)定性RSD值分別為1.1%和0.76%，按此方法顯色得到的結(jié)果是穩(wěn)定的，本實驗選擇室溫放置時間為10 min;豬苓多糖貯備液的平均質(zhì)量濃度重復(fù)性RSD為1.91%;豬苓多糖回收率為98.6%;豬苓多糖含量為879 mg/g。

4 討論

驗用水提醇沉法制備豬苓粗多糖，采用Sevage法除蛋白后再次醇沉以及透析和冷凍干燥的方法對所提取的豬苓粗多糖進(jìn)行純化。粗多糖提取物中含有大分子蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合，形成蛋白多糖，但大部分蛋白質(zhì)是以游離狀態(tài)存在于多糖粗提物中的，因而脫蛋白是分離多糖的重要步驟。粗多糖中還含有比較多的色素物質(zhì)(游離色素或結(jié)合色素)，色素的存在會污染后續(xù)處理實驗，也會影響多糖的外觀色澤，因而必須除掉。實驗中，冷凍干燥步驟較為關(guān)鍵，能使多糖在低溫(-70℃)和減壓狀態(tài)下迅速干燥，避免了糖苷鍵的斷裂。實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍干燥后的多糖溶解性明顯強(qiáng)于經(jīng)直接干燥的多糖。這是由于緩慢干燥時，存在于多糖分子周圍的水分子逐漸被抽除，多糖體分子間借次價力而緊密結(jié)合，使表觀分子量顯著增加，從而溶解性能降低。

凝膠滲透色譜法根據(jù)大分子化合物的體積及相對分子質(zhì)量的大小進(jìn)行分離，可以不破壞大分子化合物的原有結(jié)構(gòu)和性質(zhì)直接進(jìn)行分析，因此適合分析多糖。在凝膠滲透色譜中相對分子質(zhì)量大的先出峰，相對分子質(zhì)量小的后出峰，凝膠色譜圖的每個峰都反映了大分子化合物的相對分子質(zhì)量分布，通過已知相對分子質(zhì)量的多糖標(biāo)樣所作的普適校正曲線求得相對分子質(zhì)量。多糖的分子量分布形態(tài)受聚合方式和聚合因素的影響而有所不同，可用表示多分散程度的參數(shù)，如分布寬度指數(shù)表示，分布寬度越大，多糖分子大小差別就越大，分散程度就越明顯［6］。多糖是由一個個單糖基連接而成的天然大分子化合物，用高效液相色譜法分析多糖，需要將多糖水解成單糖后進(jìn)行，用來分析多糖組成情況及個組成單糖含量。

蒽酮-硫酸法測定多糖含量，是利用多糖在濃硫酸作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成羥甲基糠醛，羥甲基糠醛與蒽酮綜合成藍(lán)色化合物，比色該化合物顏色的深淺來計算多糖濃度的高低。加入蒽酮試劑時會產(chǎn)生熱量，反應(yīng)溫度和時間條件不易控制。置于冰水浴中冷卻，再平行加熱相同時間后冷卻，可以較好的提高實驗結(jié)果的現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。在該條件下顯色產(chǎn)物的最大吸收波長為610 nm。在多糖的含量測定中，因為多糖組成復(fù)雜而難以得到相應(yīng)的多糖對照品，所以多采用葡萄糖代替對照品，但這只能測得樣品中多糖的相對含量，樣品中多糖的準(zhǔn)確含量必須通過單糖和多糖之間的換算因子計算來獲得。實驗中提取物中有游離的單糖，影響測定結(jié)果，采用乙醇沉淀后進(jìn)行測定，避免單糖和小分子寡糖對多糖含量測定的影響

實驗結(jié)果顯示，豬苓多糖可能由海藻糖和葡萄糖聚合而成，其中葡萄糖占其中絕大部分，數(shù)均相對分子質(zhì)量為48232，重均相對分子質(zhì)量為117506，分子范圍為2.44。

由HPLC法測得多糖純度為68.33%，由蒽酮-硫酸法側(cè)的多糖純度為87.9%，蒽酮-硫酸法所測多糖含量明顯高于HPLC所測含量，原因可能是蒽酮-硫酸法測得的是總糖含量，且硫酸-蒽酮法操作精密度差。故可得出結(jié)論，測定多糖含量方面，HPLC法優(yōu)于硫酸-蒽酮法。

1 Nie H(聶紅)，Ma AL(馬安倫)，Shen BH(沈佰華)，et al.Immunoregulation effect of compound Polyporus umbellatus polysaccharide on mice.Chin J Cell Mol Immunol(細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志)，2000，16:384-386.

2 Zhang JC(張俊才)，Jian ZJ(簡子健)，Deng PH(鄧普輝)，et al.Effect of different adjuvants to immunity of BCG.Prog Veter Med(動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展)，2003，24(5):96-98.

3 Wei JA(危建安)，Zeng X(曾星)，Han L(韓凌)，et al.Expression of Toll signal pathway-associated genes in bladder cancer cell line stimulated by polyporus polysaccharide.Immunol J(免疫學(xué)雜志)，2009，25:375-379.

4 Wei JA(危建安)，Zeng X(曾星)，Han L(韓凌)，et al.Effect of NF-κB p65 activity through Toll-like receptors in mice bladder cancer cell line T739 induced by Bacillus Calmette-Guerin.Chin J Cell Mol Immunol(細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志)，2009，25:276-279.

5 Zhang WJ(張惟杰).Glycoconjugates biochemical research technology(糖復(fù)合物生化研究技術(shù))，2ndEd.Hangzhou: Zhejiang University Press，1999.12-13.

6 Yu SL(于世林).The HPLC methods its application(高效液相色譜方法及應(yīng)用)，1stEd.Beijing:Chemical Industry Press，1999.159.

Determination and Comparison of Polyporus Polysaccharide by HPLC and Anthrone-Sulfuric Acid Method

ZHANG Guo-wei1，LI Cai-xia2，WANG Yan-feng3，HUANG Yu2，SU Zhi-jun4，ZHENG Fang2，ZENG Xing2*1College of Chinese Medicine，Hebei University，Baoding 071002，China;2Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China;3Sinopharm ChuanKong pharmaceutical CO.，LTD，Chengdu 610051，China;4Fugu Peoples Hospital of Shanxi，F(xiàn)ugu 719400，China

This method is aimed to compare the differences between HPLC and anthrone-sulfuric acid method in determining Polyporus Polysaccharide(PPS).PPS was prepared by water extracting-alcohol precipitating，deproteinization with Sevag method，dialysis and freeze-drying.Relative molecular weight of PPS was determined by Gel Permeation in Chromatography(GPC)and the constitutes were analyzed by HPLC.At the same time，anthrone-sulfuric acid method was used to measure the content and purity of PPS.The results showed that the number-average molecular weight(Mn)of PPS wass 48，232，weight-average molecular weight(Mw)was 117，506，the polydispersity(Mw/Mn)was 2.44.PPS was composed of glucose(62.28%)and trehalose(6.05%).The PPS purify degree was 87.9%by anthrone-sulfuric acid method.Conclusively，HPLC method was superior to anthrone-sulfuric acid method in determining of PPS content.

Polyporus polysaccharide;HPLC;anthrone-sulfuric acid method

1001-6880(2011)06-1099-04

2010-08-24 接受日期:2010-12-13

廣東省科技計劃項目(2010B030700059);河北大學(xué)科研基金資助項目(2010Q46);河北省衛(wèi)生廳科研基金項目(20110514)

*通訊作者 Tel:86-20-39318678;E-mail:zengxing-china@163.com

R284.2

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