蓮的非可食用部分中生物堿分布

肖 娟，付曉燕，楊 超，李海龍，陳 琳，汪志慧，南 楠，孫智達(dá)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢430070

蓮的非可食用部分中生物堿分布

肖 娟，付曉燕，楊 超，李海龍，陳 琳，汪志慧，南 楠，孫智達(dá)*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢430070

研究了蓮的非可食用部分荷葉、蓮子心、蓮房、藕節(jié)、蓮子殼和藕皮中生物堿的組分及含量。采用乙醇水溶液從非可食用部分提取生物堿，然后用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明蓮子心提取物中含有5種主要的生物堿，其中4種為蓮心堿、異蓮心堿、荷葉堿和甲基蓮心堿。除蓮子心外的其他部分的提取物組分較相似，都含有6～8種主要的生物堿。荷葉堿在荷葉中的含量最高，可達(dá)149.64 μg/g;蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿在蓮子心中的含量最高，分別為457.76、6155.85、1420.90 μg/g。蓮的六個(gè)非可食用部分中都含有5～8種主要的生物堿，有很好的開發(fā)利用價(jià)值。

蓮;非可食用部分;生物堿;高效液相色譜;含量

蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)為多年生水生草本植物，我國(guó)南北方均有栽培。它是一種較重要的經(jīng)濟(jì)作物，不僅是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的食品，其非可食用部分也一直被中醫(yī)臨床作為藥物用以治療多種疾?。?］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)荷葉生物堿有降脂減肥［2］，抗動(dòng)脈粥樣化［3］，抗HIV病毒［4］，抑菌［5，6］和抗氧化、保肝［7］等活性。蓮子心含有淀粉、蛋白質(zhì)、多種維生素以及大量的生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類等活性物質(zhì);其中蓮心生物堿具有降血壓、抗心律失常、抗心肌缺血、抗血小板凝集、抗脂質(zhì)過氧化［1］，以及抑制小鼠運(yùn)動(dòng)活性［8］和抗HIV病毒［4］等作用。但沒有見到前人對(duì)蓮房生物堿研究報(bào)道。藕節(jié)、蓮子殼、藕皮都含鞣質(zhì)、淀粉、蛋白質(zhì)、多種維生素、少量生物堿及黃酮［1］，這些部分中生物堿被深入研究較少。本實(shí)驗(yàn)以荷葉、蓮子心、蓮子殼、蓮房、藕節(jié)、藕皮為原料，提取生物堿并進(jìn)行純化，然后以荷葉堿、蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，采用高效液相色譜法對(duì)提取物中生物堿種類和含量進(jìn)行測(cè)定和比較。為系統(tǒng)的研究蓮的各部分中的生物堿的種類和活性提供依據(jù)，為蓮資源的合理利用及藥理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

干燥荷葉、蓮子心、蓮房、藕節(jié)、蓮子殼、藕皮。2009年8月采摘荷葉，蓮蓬，2009年11月采摘蓮藕于湖北武漢，品種為武植二號(hào)。取上述各部分于60℃烘箱中烘4 h，粉碎過60目篩，用聚氯乙烯和聚乙烯的復(fù)合膜袋包裝，室溫貯藏于干燥器中備用。

荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，編號(hào)111566-200402);蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%以上)，異蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度90%以上)，甲基蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%以上)購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系;乙腈為色譜純?cè)噭?，鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、乙醇、甲醇、三乙胺、冰醋酸、氯仿等試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平(AC210S，Sartorius Corporation);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE111，瑞士Buchi公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(DK-98-IIA，天津市泰斯特儀器有限公司);pH計(jì)(pHS-3C，上海雷磁儀器廠);多功能食品粉碎機(jī)(HR1707，飛利浦家庭電器有限公司);超聲波清洗器(KQ-50B，昆山超聲儀器有限公司);瓦里安高效液相色譜儀(Varian ProStar 230型泵，Varian ProStar 330 PDA檢測(cè)器，瓦里安公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品溶液的配制

取樣品各10 g，分別加入300 mL的90%乙醇，在84℃下冷凝回流提取2 h，過濾后濾渣再提1 h，合并濾液并將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味［9］。將濾液用0.5%的HCl調(diào)節(jié)pH至2-3，過濾后用30 mL氯仿分2次萃取酸水液;棄去氯仿層，酸水液中加入0.5%NaOH調(diào)節(jié)pH至6～7，靜置、過濾后用0.5% NaOH調(diào)節(jié)pH至12以上;再用100 mL氯仿分3次萃取至水中無生物堿為止，氯仿液合并后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干;加入3 mL甲醇，在超聲波清洗器上洗脫備用［10］。

1.3.2 樣品溶液的生物堿沉淀反應(yīng)

取24支試管，四支為一組，每組分別加入樣品溶液，每管1 mL，然后每組四支管中再分別滴加硅鎢酸試劑、碘化鉍鉀試劑、碘化汞鉀試劑、碘—碘化鉀試劑一滴，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。

1.3.3 高效液相色譜法測(cè)定樣品

1.3.3.1 色譜條件［11］

色譜柱:Dismonsli-C18(200 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(56∶44∶1∶0.15，v/v);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;柱溫:25℃。

1.3.3.2 荷葉堿、蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.64 mg荷葉堿的溶液。分別吸取上述溶液(0.64 mg/mL)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別吸取20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(mAU*sec)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

稱取蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇溶解，制成1 mL含0.36 mg蓮心堿，0.66 mg異蓮心堿，0.46 mg甲基蓮心堿的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別取0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，甲醇定容至10 mL，搖勻后分別吸取20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(mAU*sec)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

1.3.3.3 樣品測(cè)定

將樣品溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笪?0 μL樣品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行一元方差分析(one-way ANOVA)，顯著水平設(shè)為P＜0.05。當(dāng)有顯著差異時(shí)，再進(jìn)行Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉淀反應(yīng)

經(jīng)四種生物堿試劑鑒定，均呈明顯的生物堿反應(yīng)，六種樣品溶液對(duì)硅鎢酸試劑、碘化鉍鉀試劑、碘化汞鉀試劑、碘—碘化鉀試劑的應(yīng)現(xiàn)象分別都是灰白色無定形沉淀、橘紅色沉淀、白色無定形沉淀和紅棕色無定形沉淀。因此可以確定蓮的這六個(gè)部分都有生物堿存在。

2.2 荷葉堿、蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程

荷葉堿、蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程分別為 y=87.268x+9.1119(r= 0.9988)，y=28.456x－10.176(r=0.9993)，y= 9.675x+0.9883(r=0.9992)，y=22.666x+ 0.158(r=0.9997)，它們分別在0.00～32.00 μg/ mL，0.00～36.00 μg/mL，0.00～66.00 μg/mL，0.00～46.00 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖

從圖1(a)和(b)中可以看出荷葉堿、蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿分別在11.53、6.14、9.11、12.18 min出峰，均基本能和其他組分達(dá)基線分離。圖1(c-h)為蓮的六個(gè)非可食用部分提取物色譜圖。

圖1 荷葉堿(a)，蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿(b)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖以及荷葉(c)、蓮子心(d)、蓮房(e)、藕節(jié)(f)、蓮子殼(g)及藕皮(h)提取物色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance of nuciferine(a);reference substance of liensinine，isoliensinine，and neferine(b);the extract of Lotus leaf(c)，Lotus plumule(d)，Lotus seed pot(e)，Lotus rhizome node(f)，Lotus seed epicarp(g)，and Lotus rhizome epicarp(h)

蓮的各部分中荷葉堿、蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿含量見表1。從表1可以發(fā)現(xiàn)，六個(gè)部分均含有荷葉堿，其中荷葉中含量最高，可達(dá)149.64 μg/g，藕節(jié)、蓮子殼和藕皮中含量較低，且無顯著差異(P＞0.05)。蓮心堿分布在蓮子心和蓮房中。異蓮心堿和甲基蓮心堿都存在于除荷葉外的其他5個(gè)部分中。異蓮心堿含量在這五個(gè)部分中都存在顯著差異(P＜0.05)，但在蓮房、蓮子殼和藕皮之間無顯著差異(P＞0.05)。甲基蓮心堿含量在這五個(gè)部分中都存在顯著差異(P＜0.05)，但在蓮房、藕節(jié)、蓮子殼以及藕皮之間無顯著差異(P＞0.05)。荷葉堿在荷葉中的含量最高，可達(dá)149.64 μg/g，蓮心堿、異蓮心堿及甲基蓮心堿在蓮子心中的含量最高，分別為457.76、6155.85和1420.90 μg/g。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖

荷葉堿的紫外最大吸收波長(zhǎng)為270 nm。除蓮子心外的其他部分中都含有荷葉堿，各部分的提取物中荷葉堿光譜圖都與荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品光譜圖相符。

圖2 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品(a)和蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品(b)的紫外光譜圖Fig.2 UV Spectra of nuciferine(a)and liensinine(b)

蓮心堿的紫外最大吸收波長(zhǎng)為282 nm。蓮心堿存在于蓮的蓮子心和蓮房部分，各部分提取物中蓮心堿的光譜圖與蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品光譜圖相符。

蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿的結(jié)構(gòu)非常相似，因此它們的光譜圖也很相似。異蓮心堿的紫外最大吸收波長(zhǎng)為284 nm。異蓮心堿存在于除荷葉外的其他5個(gè)部分中，各部分的提取物中異蓮心堿的光譜圖與異蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品光譜圖相符。

甲基蓮心堿的紫外最大吸收波長(zhǎng)為283 nm。甲基蓮心堿存在于除荷葉外的其他5個(gè)部分中，這些部分的提取物中甲基蓮心堿的光譜圖與甲基蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品光譜圖相符。

表2 蓮各部分的提取物中生物堿組分分布表Table 2 Alkaloids ingredient in the extract of six inedible parts of N.nucifera

蓮的六個(gè)非可食用部分的提取物中除了含有荷葉堿、蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿中的幾種外，還含有其他生物堿組分。蓮的各部分提取物中生物堿組分分布見表2。表2中10種生物堿組分與其總生物堿的比例，在這六個(gè)部分中都存在顯著差異(P＜0.05)。蓮子心提取物中含有5種主要的生物堿，其中包括蓮心堿、異蓮心堿、荷葉堿和甲基蓮心堿，其中異蓮心堿的含量占總生物堿的52.70%。除蓮子心外的其他5個(gè)部分的提取物組分較相似，它們都含有6～8種主要的生物堿。藕節(jié)、蓮子殼和藕皮提取物中都有8種主要的生物堿，而且這8種生物堿的種類是相同的，其中包括異蓮心堿、荷葉堿、甲基蓮心堿。藕節(jié)和蓮子殼提取物中最主要的生物堿組分均為4.08、5.85 min出峰的生物堿和12.18 min出峰的甲基蓮心堿。而藕皮提取物中最主要的生物堿組分為4.08、5.85 min出峰的生物堿。相對(duì)蓮子殼和藕皮，蓮房提取物中生物堿組分少了7.29 min出峰的生物堿卻多了6.14 min出峰的蓮心堿;荷葉提取物中生物堿組分少了7.29 min的生物堿及9.11 min出峰的異蓮心堿和12.18 min出峰的甲基蓮心堿，同時(shí)多了14.01 min出峰的生物堿。

表3 單位質(zhì)量的蓮各部分干物質(zhì)的提取物中總生物堿與提取物含量表(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)*Table 3 Contents of total alkaloids and extracts of six inedible parts with same wet weight(Mean±SD)*

從表3中可以看出，假設(shè)單位質(zhì)量的蓮子殼干物質(zhì)所得到的提取物中總生物堿量為1，則提取物的量為2.60，相同單位質(zhì)量的蓮的六個(gè)非可食用部分干物質(zhì)所得到的提取物和總生物堿量都是:蓮子心＞荷葉＞藕皮＞蓮房＞藕節(jié)＞蓮子殼。荷葉、蓮子心、蓮房、藕節(jié)、蓮子殼、藕皮提取物中總生物堿量占提取物量的比例分別為:90.52%、59.60%、59.18%、31.12%、38.41%、79.20%，其中比例最高的是荷葉，其次是藕皮，比例最低的是藕節(jié)?？偵飰A量、提取物量及比例在蓮的六個(gè)部分之間顯著差異(P＜0.05)。但是總生物堿量在蓮子殼和藕節(jié)之間不存在顯著差異(P＞0.05)，提取物量在蓮子殼和藕節(jié)之間不存在顯著差異(P＞0.05)，提取物中總生物堿量占提取物量比例在蓮子心和蓮房之間不存在顯著差異(P＞0.05)。

3 結(jié)論

荷葉、蓮子心、蓮房、藕節(jié)、蓮子殼、藕皮均含有生物堿，其中蓮子心含有5種生物堿，主要為蓮心堿、異蓮心堿、荷葉堿和甲基蓮心堿及一種痕量的未知生物堿;蓮的其他非可食部分的生物堿組分較相似，均含有6～8種主要的生物堿。各部分生物堿的相對(duì)含量差異顯著(P＜0.05)。荷葉堿在荷葉中的含量最高，而蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿在蓮子心中的含量最高。蓮的6個(gè)非可食用部分的總生物堿量大小順序?yàn)?蓮子心＞荷葉＞藕皮＞蓮房＞藕節(jié)＞蓮子殼。以上結(jié)果為系統(tǒng)研究蓮的各部分的生物堿的種類及含量提供了依據(jù)，也為蓮資源的合理利用及藥理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。但是，由于缺少蓮中生物堿的標(biāo)準(zhǔn)品，已有的研究局限在測(cè)定蓮心堿、異蓮心堿、荷葉堿和甲基蓮心堿的含量及總生物堿含量和活性方面。因此，分離蓮中生物堿單體以獲取標(biāo)準(zhǔn)品迫在眉睫，從而使得能盡快地建立一套簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的蓮中生物堿的檢測(cè)方法，以更有效的地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

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Analysis and Determination of Alkaloids in the Inedible Parts of Nelumbo nucifera Gaertn

XIAO Juan，F(xiàn)U Xiao-yan，YANG Chao，LI Hai-long，CHEN Lin，WANG Zhi-hui，NAN Nan，SUN Zhi-da*
College of Food Science and Technology of Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China

To study the compositions of alkaloids in six inedible parts of Nelumbo nucifera Gaertn，the alkaloids of lotus leaf，lotus plumule，lotus seed pot，lotus rhizome node，lotus seed epicarp，and lotus rhizome epicarp were extracted by ethanol water and then the extracts were analysed by HPLC，respectively.Results showed that there were five kinds of akaloids in the extract of lotus plumule，and four of them were liensinine，isoliensinine，neciferine and neferine.The extracts of the other five parts had the similar compositions of alkaloids dominant by 6 to 8 kinds of alkaloids.The content of nuciferine in lotus leaf was the highest，reaching 149.64 μg/g，while the contents of liensinine，isoliensinine，and neferine in lotus plumule were the highest with 457.76，6155.85，and 1420.90 μg/g，respectively.It can be inferred that there are 5 to 8 kinds of alkaloids in the six inedible parts of Nelumbo nucifera Gaertn，thus should be well developed and utilized in production.

Nelumbo nucifera Gaertn;inedible part;alkaloids;HPLC;content

1001-6880(2011)06-1133-06

2010-06-08 接受日期:2010-12-09

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD27B09-4)

*通訊作者 Tel:86-27-87283201;E-mail:sunzhida@mail.hzau.edu.cn

R284.2;R927.2

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