胰蛋白酶原激活肽和白細(xì)胞介素-6在實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎中的意義

高 軍，田志軍，邱寶樑 ，李 非，孫家邦

1北京市第六醫(yī)院普外科，北京 1000072首都醫(yī)科大學(xué) 附屬宣武醫(yī)院普外科，北京 100053

·論著·

胰蛋白酶原激活肽和白細(xì)胞介素-6在實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎中的意義

高 軍1，田志軍1，邱寶樑1，李 非2，孫家邦2

1北京市第六醫(yī)院普外科，北京 100007
2首都醫(yī)科大學(xué) 附屬宣武醫(yī)院普外科，北京 100053

目的探討血漿胰蛋白酶原激活肽(TAP)和血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)作為早期預(yù)測實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎病情嚴(yán)重程度指標(biāo)的可行性。方法雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分成5組。分別是3%?；悄懰徕c逆行膽胰管注射組、5%?；悄懰徕c逆行膽胰管注射組、3%?；悄懰徕c逆行膽胰管注射后0.5h經(jīng)股靜脈注入烏司他丁組、0.9%生理鹽水逆行膽胰管注射組和假手術(shù)組(只行開、關(guān)腹術(shù))。每組18只大鼠，每組再隨機(jī)分成3組，分別于制模后3、6、24 h后取血處死，留取標(biāo)本。觀察血清淀粉酶、血漿TAP水平、血清IL-6水平變化，并在光鏡下對(duì)胰腺病變進(jìn)行雙盲組織病理學(xué)評(píng)分。結(jié)果制模后3和6 h血漿TAP水平5%牛磺膽酸鈉逆行膽胰管注射組[(4.798±0.169)和 (3.999±0.299)nmol/L]比3%?；悄懰徕c逆行膽胰管注射組[(2.416±0.148)和(3.356±0.211)nmol/L]明顯增高(P<0.01)；制模后6 h，血清IL-6水平5%?；悄懰徕c逆行膽胰管注射組(1339.51±56.43)pg/ml明顯高于3%?；悄懰徕c逆行膽胰管注射組(619.07±42.25)pg/ml(P<0.01)。結(jié)論在輕重不同的急性胰腺炎模型中，胰腺病理改變越嚴(yán)重，血漿TAP和血清IL-6峰值出現(xiàn)越早。血漿TAP水平可以作為早期精確預(yù)測急性胰腺炎模型胰腺病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

胰蛋白酶原激活肽； 白細(xì)胞介素-6；急性胰腺炎；胰酶抑制劑

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是外科常見的急腹癥之一。多數(shù)AP是一種自限性疾病，15%～20%的患者病情可能惡化成為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)，SAP臨床表現(xiàn)兇險(xiǎn)，病死率高[1]，有文獻(xiàn)報(bào)道可達(dá)20%～30%[2]。國內(nèi)外眾多研究者一直想篩選出一個(gè)早期判斷AP病情嚴(yán)重程度的可靠指標(biāo)，以鑒別SAP患者和可能發(fā)展成為SAP的患者并給予早期積極的治療，以提高SAP的治療效果。胰蛋白酶原激活肽(trypsinogen activation peptides, TAP)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)就是近年引人關(guān)注的兩個(gè)指標(biāo)。本研究通過不同嚴(yán)重程度的大鼠急性胰腺炎模型中血漿TAP和血清IL-6水平的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其與胰腺組織病理學(xué)改變之間的關(guān)系，探討TAP和IL-6作為早期預(yù)測此AP模型嚴(yán)重程度的指標(biāo)的可行性，為血漿TAP和血清IL-6在臨床AP患者診治方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

材料和方法

分組將90只Sprague-Dawley(SD)大鼠(購自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí))采用抽簽法隨機(jī)分成5組: 3%?；悄懰徕c逆行膽胰管注射組[水腫性胰腺炎(edema pancreatitis，EP)組]；5%牛磺膽酸鈉逆行膽胰管注射組[壞死性胰腺炎(necrosis pancreatitis，NP)組]、3%?；悄懰徕c逆行膽胰管注射后0.5 h經(jīng)股靜脈注入烏司他丁組[胰腺炎治療(treatment pancreatitis，TP)組]； 0.9%生理鹽水逆行膽胰管注射組[胰腺炎對(duì)照(control pancreatitis，CP)組]、假手術(shù)(sham operation，OP)組(只行開、關(guān)腹術(shù))。每組18只大鼠，每組再采用抽簽法隨機(jī)分成3小組，每組6只大鼠，分別于制模后3、6、24 h后處死。

方法動(dòng)物模型參照Aho等[3]的方法制作，用微量注射泵(SP-100型，日本JMS公司產(chǎn)品)向膽胰管內(nèi)恒速注入?；悄懰徕c(美國Sigma公司產(chǎn)品)溶液，其中，EP組和TP組注入的?；悄懰徕c濃度為3%，NP組注入的牛磺膽酸鈉濃度為5%。TP組于制模后0.5 h經(jīng)股靜脈注入烏司他丁(天普生物化學(xué)制藥有限公司產(chǎn)品) 2.5萬U/ml,36 ml/h,持續(xù)1 min。CP組注入與?；悄懰徕c等量的0.9%生理鹽水。OP組為假手術(shù)組。各組大鼠分別于制模后3、6、24 h后處死，離心(應(yīng)用TGL-16G恒溫高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn))后留取血漿和血清標(biāo)本，測定血漿TAP水平和血清IL-6水平。另取部分血清測定淀粉酶，將胰頭部分胰腺作病理切片檢查。

胰腺組織病變嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)胰腺組織病變嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)用改良的Schmidt法[4]，并參照Pozsar等[5]的方法在光鏡下對(duì)胰腺病變進(jìn)行雙盲評(píng)分來確定。具體評(píng)分方法：(1)水腫：0=無，1=輕度葉間隙增寬，2=重度葉間隙增寬，3=腺泡間隙增寬，4=細(xì)胞間隙增寬；(2)壞死：0=無，1=壞死面積1%～10%，2=壞死面積11%～20%，3=壞死面積21%～30%，4=壞死面積大于30%；(3)出血：0=無，1=有；(4)炎性細(xì)胞浸潤：計(jì)數(shù)高倍視野下血管周圍或小葉內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量，0=0～1個(gè)，1=2～10個(gè)，2=11～20個(gè)，3=21～30個(gè)，4=大于30個(gè)或出現(xiàn)微膿腫。每只動(dòng)物胰腺組織病理學(xué)評(píng)分的最后得分為以上4項(xiàng)評(píng)分相加后所得的分值。

血漿TAP和血清IL-6的測定方法血漿TAP水平的測定采用TAP酶免疫測定(EIA)試劑盒(購自愛爾蘭Biotrin International公司)完成。血清IL-6水平的測定采用大鼠IL-6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(購自美國Endogen公司)完成，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀采用LP-400型酶標(biāo)儀(法國Basture公司產(chǎn)品)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析各組均數(shù)的差異，然后再進(jìn)行各組間的兩兩比較。

結(jié) 果

血清淀粉酶水平制模后3和6 h，血清淀粉酶水平EP、NP、TP、CP組與OP組相比明顯升高(P<0.01)(表1)。

胰腺病理改變及組織病理學(xué)評(píng)分假手術(shù)組胰腺結(jié)構(gòu)基本正常。EP、NP、TP、CP組胰腺組織有不同程度的胰腺間質(zhì)水腫、腺泡細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤和胰腺間質(zhì)出血。制膜后3、6和24 h，胰腺組織病理學(xué)評(píng)分EP、NP、TP、CP組明顯高于OP組(P<0.01)，NP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于EP組(P<0.01)。制模后24 h，TP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分明顯低于EP組(P<0.01)(表2)。

血漿TAP水平EP、NP、TP、CP組與OP組比較，血漿TAP水平在各觀察時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；制模后3和6 h,NP組血漿TAP水平明顯高于EP組(P<0.01)；制模后6 h,TP組血漿TAP水平明顯低于EP組(P<0.01)(表3)。

表 1 各組大鼠制模后不同時(shí)相血清淀粉酶水平

OP：假手術(shù)；EP:水腫性胰腺炎; NP :壞死性胰腺炎; TP:胰腺炎治療; CP:胰腺炎對(duì)照;與OP組比較，aP<0.01; 與EP組比較，bP<0.01

OP: sham operation; EP: edema pancreatitis; NP: necrosis pancreatitis; TP: treatment pancreatitis; CP: control pancreatitis;aP<0.01 compared with OP group;bP<0.01 compared with EP group

血清IL-6水平制模后3、6和24 h，EP、NP、TP組與OP組相比，血清IL-6水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。制膜后6 h,NP組血清IL-6水平明顯高于EP組(P<0.01)；制膜后6和24 h，TP組血清IL-6水平明顯低于EP組(P<0.01)(表4)。

表 2 各組動(dòng)物制模后不同時(shí)相胰腺病理組織學(xué)評(píng)分

與OP組比較，aP<0.01；與EP組比較，bP<0.01

aP<0.01 compared with OP group ;bP<0.01 compared with EP group

表 3 各組動(dòng)物制模后不同時(shí)相血漿胰蛋白酶原激活肽水平

與OP組比較，aP<0.01；與EP組比較，bP<0.01

aP<0.01 compared with OP group ;bP<0.01 compared with EP group

表 4 各組大鼠制模后不同時(shí)相血清白細(xì)胞介素-6水平

與OP組比較，aP<0.01；與EP組比較，bP<0.01

aP<0.01 compared with OP group；bP<0.01 compared with EP group

討 論

TAP是位于脊椎動(dòng)物胰蛋白酶原氨基末端的激活肽，在實(shí)驗(yàn)性AP模型和臨床AP患者中，胰腺內(nèi)的胰蛋白酶原異常激活導(dǎo)致TAP直接被釋放進(jìn)入腹腔和血液循環(huán)，激活的胰蛋白酶啟動(dòng)胰腺自身消化的鏈鎖，導(dǎo)致胰腺組織內(nèi)其他酶原的激活，造成胰腺損傷。定量測定TAP可以定量反應(yīng)胰蛋白酶原激活的程度[6]。本研究應(yīng)用?；悄懰徕c逆行膽胰管注射誘發(fā)的大鼠AP模型與人類急性壞死性胰腺炎早期在形態(tài)學(xué)改變、病理生理學(xué)改變、生化改變及并發(fā)癥方面[7]極其相似。

本研究最終胰腺病變嚴(yán)重程度有明顯差異的EP組與NP組大鼠，在制模后3 h，胰腺病理組織學(xué)改變尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，EP組與NP組血漿TAP水平差異已有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種改變一直維持到制模后6 h。而制模后24 h胰腺病理組織學(xué)改變最嚴(yán)重，且兩組病理改變差異最明顯時(shí)，血漿TAP水平差異已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在輕重不同的AP模型中，血漿TAP水平的差異先于胰腺組織病理學(xué)改變差異的出現(xiàn)。在24h胰腺病理改變最嚴(yán)重時(shí)，血漿TAP水平與胰腺病變不平行可能是由于胰腺病變的發(fā)展導(dǎo)致胰腺微循環(huán)灌注受損，胰腺組織中的TAP向血中釋放減少造成的[8]。

IL-6是一種重要的炎癥介質(zhì), 在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在全身炎性反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮主導(dǎo)作用, 可敏感地反應(yīng)組織損傷的程度[9-10]。本研究制模后6 h，NP組血清IL-6水平比EP組明顯增高，而EP組與NP組動(dòng)物胰腺組織病理學(xué)改變的差異也開始于制模后6 h，故此時(shí)的血清IL-6水平可以準(zhǔn)確反映EP、NP兩組動(dòng)物胰腺病變的嚴(yán)重程度。NP組血清IL-6水平在達(dá)到峰值后迅速下降，由于EP組血清IL-6水平峰值出現(xiàn)比NP組晚，到制模后24 h，兩組血清IL-6水平的差異已不能夠反映出兩組動(dòng)物胰腺病變的嚴(yán)重程度的差異。本研究表明，胰腺病變越嚴(yán)重，血清IL-6峰值出現(xiàn)越早，早期測定血清IL-6水平可以預(yù)測此AP模型胰腺病變的嚴(yán)重程度。

烏司他丁是從男性尿液中分離純化的蛋白酶抑制劑, 可以抑制體內(nèi)廣泛分布的絲氨酸蛋白酶活性，具有減少炎性細(xì)胞浸潤、抑制多種炎癥因子和介質(zhì)釋放的功能[11]。本研究制模后6 h，TP組血漿TAP水平比EP組明顯降低；制模后6和24 h，TP組血清IL-6水平比EP組明顯降低；制模后24 h，TP組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分明顯低于EP組，表明烏司他丁能夠不同程度地抑制胰蛋白酶原的激活和IL-6的產(chǎn)生及胰腺病變的發(fā)展。

本研究表明，在輕重不同的AP模型中,血漿TAP水平的差異早于血清IL-6水平差異的出現(xiàn)，血漿TAP水平的峰值早于血清IL-6水平峰值的出現(xiàn)。因而作為早期預(yù)測AP嚴(yán)重程度的指標(biāo)，TAP的預(yù)測價(jià)值高于IL-6的預(yù)測價(jià)值。近年來，TAP作為早期預(yù)測臨床AP患者病情嚴(yán)重程度指標(biāo)的研究已在國外多個(gè)醫(yī)療中心內(nèi)進(jìn)行[12-14]。本研究表明：TAP對(duì)SAP的早期預(yù)測有較高的應(yīng)用價(jià)值，TAP有望成為臨床AP患者的一項(xiàng)常規(guī)檢查指標(biāo)。

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SignificanceofTrypsinogenActivationPeptidesandInterleukin-6inExperimentalAcutePancreatitis

GAO Jun1, TIAN Zhi-jun1,QIU Bao-liang1,LI Fei2,SUN Jia-bang2

1Department of General Surgery, Beijing NO.6 Hospital, Beijing 100007,China
2Department of General Surgery,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing 100053,China

GAO Jun Tel:010-64035566-2483,E-mail: J-Kao@163.com

ObjectiveTo explore the feasibility of using plasma trypsinogen activation peptides (TAP) and serum interleukin-6(IL-6) as early markers for predicting the severity of experimental acute pancreatitis.MethodsNinety male adult Sprague-Dawley rats were equally randomized into five groups: edema pancreatitis group, treated with retrograde ductal infusion of 3% sodium taurocholate solution; necrosis pancreatitis group, treated with retrograde ductal infusion of 5% sodium taurocholate solution; treatment pancreatitis group, treated with retrograde ductal infusion of 3% sodium taurocholate solution and ulinastatin intravenous infusion half an hour later; control pancreatitis group, treated with 0.9% normal saline retrograde ductal infusion; and sham operation group, treated with sham operation. Rats in each group were equally randomized into three subgroups, which were killed by exsanguination 3, 6, or 24 hours after infusion, and blood specimens were obtained. Serum amylase, plasma TAP, and serum IL-6 were determined. The severity of pancreatitis was scored by two blinded pathologists under microscope.ResultsAt 3 and 6 hours after infusion, plasma TAP concentration of necrosis pancreatitis group [(4.798±0.169) and (3.999±0.299)nmol/L, respectively]were significantly higher than those of edema pancreatitis group [(2.416±0.148) and (3.356±0.211)nmol/L, respectively] (P<0.01); at 6 hours after infusion, serum IL-6 level of necrosis pancreatitis group [(1339.51±56.43)pg/ml]was significantly higher than that of edema pancreatitis group [(619.07±42.25)pg/ml] (P<0.01).ConclusionsIn this acute pancreatitis model, the peak levels of plasma TAP and serum IL-6 may appear earlier in rats with severer disease. Serum TAP level may be used as a marker for the accurate early prediction of the severity of acute pancreatitis.

trypsinogen activation peptides; interleukin-6; acute pancreatitis; pancreatin inhibitor

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：205-209

高 軍 電話：010-64035566-2483，電子郵件：J-Kao@163.com

R657. 5

A

1000-503X(2011)02-0205-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.021

2010-09-08)