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    口蝦蛄提取物對人鼻咽癌細(xì)胞P53、COX-2和VEGF表達(dá)的影響*

    2011-11-22 07:03:13顧帝水黃培春
    中國病理生理雜志 2011年2期

    孔 霞, 顧帝水, 陳 錦, 黃培春

    (廣東醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室, 廣東 東莞 523808)

    口蝦蛄提取物對人鼻咽癌細(xì)胞P53、COX-2和VEGF表達(dá)的影響*

    孔 霞, 顧帝水, 陳 錦, 黃培春△

    (廣東醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室, 廣東 東莞 523808)

    目的研究口蝦蛄提取物(EOS)對人低分化鼻咽癌細(xì)胞系(CNE-2Z)中P53、環(huán)氧化酶2(COX-2)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響及意義。方法不同濃度EOS(0 mg/L、125 mg/L、250 mg/L和500 mg/L)作用CNE-2Z細(xì)胞24 h后,Western blotting檢測P53蛋白表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)法及RT-PCR法分別檢測COX-2 、VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果CNE-2Z細(xì)胞中P53蛋白、COX-2和VEGF蛋白和mRNA表達(dá)均隨EOS作用濃度增高而逐漸降低,呈量效關(guān)系(P<0.01);且COX-2 和VEGF表達(dá)量呈正相關(guān)(P<0.05),COX-2 和P53表達(dá)量亦呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論EOS可能通過抑制CNE-2Z細(xì)胞中P53蛋白的表達(dá),干擾COX-2和VEGF的表達(dá)而發(fā)揮其抗腫瘤作用的。

    口蝦蛄; 鼻咽癌; 蛋白質(zhì)P53; 環(huán)氧化酶2; 血管內(nèi)皮生長因子

    口蝦蛄提取物(extract ofOratosquilla, EOS)是本課題組從海洋生物口蝦蛄中提取和分離的抗鼻咽癌活性成分[1-3],其主要化學(xué)成分可能是生物堿類[3]。但其具體抗癌機(jī)制還不清楚,需要進(jìn)一步深入研究。本研究旨在進(jìn)一步探討EOS對人低分化鼻咽癌細(xì)胞系(CNE-2Z)中P53、環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2) 和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響,以揭示EOS抗癌的可能機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1材料

    EOS及CNE-2Z均由廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供;RT-PCR試劑盒(Qiagen);RNA提取試劑盒(Trizol,Invitrogen);PCR引物(由上海生工合成);鼠抗人P53、COX-2和VEGF單克隆抗體為Santa Cruz。

    2方法

    2.1CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    2.2EOS的提取、配制及實(shí)驗(yàn)分組 采用系統(tǒng)溶劑法提取分離獲得口蝦蛄乙酸乙酯提取物即EOS,具體方法參見文獻(xiàn)[1]。EOS不溶于水,以二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成1 kg/L,分裝于4 ℃保存。臨用前將EOS稀釋成所需的濃度。實(shí)驗(yàn)分4組:實(shí)驗(yàn)前將溶解后的EOS加入各組細(xì)胞培養(yǎng)液中,使其終濃度分別為EOS 0 mg/L(對照組)、EOS 125 mg/L(低濃度組)、EOS 250 mg/L(中濃度組)、EOS 500 mg/L(高濃度組),并使各組DMSO終濃度≤0.1%。

    2.3免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測COX-2和VEGF蛋白表達(dá) 將CNE-2Z細(xì)胞制成1×108cells/L 的細(xì)胞懸液,接種于預(yù)先置有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的EOS,并使各組培養(yǎng)液DMSO濃度均為0.1%,同時設(shè)陰性對照組;EOS作用24 h后棄上清,用PBS洗3遍,再用冰丙酮固定15 min,自然干燥后采用SP法檢測。

    COX-2和VEGF皆為胞質(zhì)著色。胞漿或胞膜出現(xiàn)棕色或棕褐色顆粒判斷為陽性細(xì)胞,并采用LEICA-Q500IW圖像分析儀定量檢測陽性細(xì)胞平均吸光度A值代表其表達(dá)量。

    2.4RT-PCR法檢測COX-2 mRNA和VEGF mRNA表達(dá) 加入EOS后各組CNE-2Z細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,用Trizol等試劑提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計測定RNA的含量和純度,取A260/A280>1.8的樣品用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件和Web Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計。GADPH上游引物序列 5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’,下游引物序列 5’-TCATTTTGGAGGGATCTCGC -3’,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為231 bp;COX-2上游引物序列 5’-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT-3’,下游引物序列 5’-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為305 bp;VEGF上游引物序列 5’-CGAAACCATGAACTTTCTGCTGTC-3’,下游引物序列 5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為452 bp和583 bp。對應(yīng)為VEGF121和VEGF165。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性 5 min;95 ℃ 1 min,50 ℃ (COX-2) 或 52 ℃ (VEGF)1 min,72 ℃ 1 min,共 30 (COX-2) 或 32(VEGF) 個循環(huán);最后 72 ℃延伸5 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用 20 g/L瓊脂糖凝膠 (內(nèi)含嗅化乙啶) 電泳。紫外燈下觀察并用Grab2It成像系統(tǒng)照相,然后用 Gelworks 1D interdiate軟件分析各條帶的積分吸光度(IA),以IA(COX-2 或 VEGF)/IA(GADPH) 比值表示目的基因的相對表達(dá)量。

    2.5Western blotting檢測P53的表達(dá) 細(xì)胞處理同RT-PCR,取 1×106個細(xì)胞以細(xì)胞裂解液裂解,沸水變性3-5 min,超聲波粉碎30 s,13 000 r/min 4 ℃離心10 min,取上清,考馬斯亮藍(lán)G-250標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜,膜與鼠抗人P53單克隆抗體4 ℃孵育過夜,再與羊抗鼠IgG 37 ℃孵育2 h,ECL檢測,β-actin作為內(nèi)參照。圖像經(jīng)Scion Image軟件進(jìn)行吸光度值分析,并與內(nèi)參照β-actin比較,以相對吸光度值代表蛋白表達(dá)量。

    3統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié) 果

    1免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

    COX-2和VEGF蛋白在CNE-2Z 細(xì)胞中呈陽性表達(dá),陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿著棕褐色,染色強(qiáng)度與其表達(dá)量有相關(guān)性。經(jīng)不同濃度的EOS處理后的CNE-2Z 細(xì)胞中COX-2和VEGF蛋白的陽性表達(dá)率隨EOS的增高而降低,見圖1,呈量效關(guān)系(P<0.01)。

    Figure 1. Effects of EOS on the expression of COX-2 and VEGF in CNE-2Z cells(×200).

    2RT-PCR法結(jié)果

    如圖2所示,CNE-2Z細(xì)胞COX-2 mRNA和VEGF mRNA表達(dá)擴(kuò)增條帶隨EOS作用濃度的增加而漸減弱(n=3,P<0.01),且COX-2 mRNA與VEGF mRNA相對表達(dá)量的變化趨勢存在正相關(guān)(r=0.9720,P<0.05)。

    Figure 2. Effects of EOS on the expression of COX-2 mRNA and VEGF mRNA in CNE-2Z cells.s. n=3.M: DNA marker;Lane 1: control group;Lane 2: EOS 125 mg/L group;Lane 3:EOS 250 mg/L group;Lane 4:EOS 500 mg/L group. **P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs other groups.

    3P53蛋白表達(dá)情況

    如圖3所示,EOS作用于CNE-2Z細(xì)胞24 h后,隨著EOS濃度的增加, P53蛋白的表達(dá)逐漸下降(n=3,P<0.05),且P53表達(dá)量與COX-2表達(dá)量的變化趨勢呈正相關(guān)(r=0.9607,P<0.05)。

    Figure 3. Effects of EOS on the expression of P53 in CNE-2Z cells.s. n=3. Lane 1: control group;Lane 2:EOS 125 mg/L group;Lane 3:EOS 250 mg/L group;Lane 4:EOS 500 mg/L group. **P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs other groups.

    討 論

    從海洋生物中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)是目前抗癌藥物研究的熱點(diǎn)之一。然而,利用海洋生物抗鼻咽癌的研究國內(nèi)外報道極少。近年來,本研究室利用系統(tǒng)溶劑法從海洋生物口蝦蛄中提取了抗鼻咽癌活性成分,發(fā)現(xiàn)其主要的化學(xué)成分可能是生物堿類,并申請了中國發(fā)明專利(專利號為ZL99102633.0)[3]。前期研究發(fā)現(xiàn),口蝦蛄提取物能抑制鼻咽癌低分化細(xì)胞系CNE-2Z細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長,并能降低 CNE-2Z細(xì)胞體外侵襲能力[2]。這證明口蝦蛄提取物確實(shí)具有抗鼻咽癌的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)口蝦蛄提取物不僅能夠抑制鼻咽癌低分化和高分化細(xì)胞系CNE-2Z和CNE1的增殖,而且還能促進(jìn)癌細(xì)胞的分化,并對其中的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。但其具體抑癌機(jī)制還不清楚,需要進(jìn)一步深入研究。據(jù)此,本研究選擇了P53、COX-2和VEGF作為研究對象探討EOS抗腫瘤的可能機(jī)制。

    COX-2是催化花生四烯酸產(chǎn)生多種PGE2的限速酶,它在正常組織中一般不表達(dá),但在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達(dá)增加[4-6]。研究資料表明[7,8],COX-2與腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡紊亂、腫瘤新生血管的生成以及細(xì)胞間的黏附、侵襲等多個環(huán)節(jié)有關(guān)。COX-2抑制劑能抑制腫瘤細(xì)胞的生長[9],誘導(dǎo)其凋亡,并能對抗腫瘤血管的生成,抑制腫瘤的侵襲性[10]。因此COX-2可作為鼻咽癌防治研究中的新靶點(diǎn)。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和RT-PCR法分別檢測了EOS對CNE-2Z細(xì)胞中COX-2在蛋白和基因水平的影響,結(jié)果表明隨著EOS作用濃度的增加, COX-2在蛋白和基因水平的表達(dá)逐漸減弱,說明EOS的抗腫瘤作用可能與抑制COX-2的表達(dá)有關(guān)。

    有研究表明COX-2的抗凋亡能力與P53有關(guān)。p53基因是研究最為廣泛深入的抑癌基因之一,它是細(xì)胞生長周期中負(fù)調(diào)控因子,與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)功能有關(guān)。p53基因分為野生型和突變型2種,野生型p53基因在某些致癌因素的作用下可發(fā)生突變,成為突變型p53基因,突變型p53基因在細(xì)胞內(nèi)積聚,促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。由于野生型P53蛋白在體內(nèi)的半衰期極短,不易測出。鼻咽癌組織中p53基因突變率低,但是在細(xì)胞株和移植瘤中p53基因突變率增高[11,12]。因此,我們所檢測到的為突變型p53。目前研究表明,野生型p53競爭性地結(jié)合COX-2上游啟動子序列的TATA盒而抑制其表達(dá)。當(dāng)野生型p53發(fā)生突變后,失去了對COX-2表達(dá)的抑制而促使COX-2表達(dá)上調(diào)[13]。COX-2的過表達(dá)導(dǎo)致Bcl-2/Bax比率增大,改變了Bcl-2與Bax之間的平衡從而抑制凋亡。本實(shí)驗(yàn)中Weatern blotting法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CNE-2Z細(xì)胞中有較高的突變型P53蛋白的表達(dá),且隨著EOS濃度的增加突變型P53蛋白的表達(dá)逐漸降低,并且這種變化趨勢和COX-2的變化有顯著相關(guān)性(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了EOS也可能通過下調(diào)突變型P53蛋白的表達(dá)而干擾了COX-2的表達(dá),從而抑制了CNE-2Z細(xì)胞的生長。

    COX-2促進(jìn)腫瘤形成還與其促進(jìn)了腫瘤新生血管的生成有關(guān)。研究表明COX-2及其產(chǎn)物PGE2還可以促進(jìn)腫瘤VEGF的表達(dá)而導(dǎo)致血管生成[14],并且這種作用可被COX-2抑制劑所抑制[15]。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和RT-PCR法分別檢測了EOS對CNE-2Z細(xì)胞中VEGF在蛋白和基因水平的影響,結(jié)果表明EOS作用濃度的增加,VEGF在蛋白和基因水平的表達(dá)逐漸減弱,并且這種變化趨勢和COX-2的變化有顯著相關(guān)性(P<0.05)。說明EOS的抗腫瘤作用可能與下調(diào)COX-2的表達(dá)從而抑制了VEGF的表達(dá)有關(guān)。

    以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EOS可能通過下調(diào)CNE-2Z細(xì)胞中突變型P53蛋白的表達(dá)而干擾了COX-2和VEGF的表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用的,這為EOS的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了新的思路。

    [1] 孔 霞,顧帝水,黃培春,等.口蝦蛄提取物對人鼻咽癌細(xì)胞端粒酶活性的影響[J].中國病理生理雜志,2010,26(5):937-940.

    [2] 顧帝水,黃培春,孔 霞.口蝦蛄提取物對人鼻咽癌裸鼠移植瘤生長的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,14(14):1825-1826,1828.

    [3] 葉才果,潘海燕,黃培春,等.海洋來源的口蛄蝦生物堿的分離純化和抗鼻咽癌作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(12):2965-2966.

    [4] 許新華,胡國清,李道俊,等.環(huán)氧化酶-2對鼻咽癌血管生成及預(yù)后的影響[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志,2003,12(3):154-157.

    [5] Lanza-Jacoby S, Burd R, Rosato FE Jr, et al. Effect of simultaneous inhibition of epidermal growth factor receptor and cyclooxygenase-2 in HER-2 /neu-positive breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(20 Pt 1): 6161-6169.

    [6] Lev-Ari S, Starr A, Vexler A, et al.Inhibition of pancreatic and lung adenocarcinoma cell survival by curcumin is associated with increased apoptosis, down-regulation of COX-2 and EGFR and inhibition of Erk1/2 activity[J]. Anticancer Res, 2006, 26(6B):4423-4430.

    [7] Joki T, Heese O, Nikas DC, et al. Expression of cyclooxygenase-2(COX-2) in human glioma andinvitroinhibition by a specific COX-2 inhibitor NS-398[J].Cancer Res,2000,60(17):4926-4931.

    [8] Murakami A, Hayashi R, Takana T, et al. Suppression of dextran sodium sulfate-induced colitis in mice by zerumbone, a subtropical ginger sesquiterpene, and nimesulide: separately and in combination [J].Biochem Pharmacol,2003,66(7):1253-1261.

    [9] Lanza-Jacoby S, Miller S, Flynn J, et al. The cyclooxygenase-2 inhibitors, celecoxib, prevents the development of mammary tumor in HER-2/neu mice [J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2003,12(12):1486-1491.

    [10]Liu XH, Kirschbaum A, Yao S, et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor by persistent induction of cyclooxygenase-2 in a metastatic human prostate cancer cell line[J]. Clin Exp Metastasis,1999,17(8):687-694.

    [11]宋 毅,王 煉,黃光琦,等.腫瘤抑制基因p53及Rb在鼻咽癌中的表達(dá)[J].華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1997,28(3):268-271.

    [12]李滿枝,陳 軍,汪慧民.鼻咽癌中p53基因突變的研究[J].癌癥,1998,17(4):246-248.

    [13]Leung WK, To KF, Ng YP,et al.Association between cyclooxygenase-2 overexpression and missensep53 mutations in gastricancer[J]. Br J Cancer, 2001, 84(3): 335-339.

    [14]Mestre JR, Mackrell PJ, Rivadeneira DE, et al. Redundancy in the signaling pathways and promoter elements regulating cyclooxygenase-2 gene expression in endotoxintreated macrophage/monocytic cells[J]. J Biol Chem,2001,276(6):3977-3982.

    [15]Kirkpatridk K, Ogunkolade W, Elkak A, et al.The mRNA expression of cyclooxygenase-2(COX-2) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in human breast cancer[J].Curr Med Res Opin,2002,18(4):237-241.

    EffectsofextractofOratosquillaonexpressionofP53,COX-2andVEGFinhumannasopharyngealcarcinomacellline

    KONG Xia, GU Di-shui, CHEN Jin, HUANG Pei-chun

    (DepartmentofPathophysiology,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China.E-mail: 13828283890@139.com)

    AIM: To study the inhibitory effect of the extract ofOratosquilla(EOS) on the expression of P53, cyclooxygenase-2(COX-2) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z.METHODSCNE-2Z cells were treated with different concentrations of EOS for 24 h. The methods of RT-PCR and immunocytochemistry were used to detect the expression of COX-2 and VEGF at mRNA and protein levels, respectively. The protein expression of P53 was determined by Western blotting.RESULTSAfter treated with EOS, the protein expression of P53 in CNE-2Z cells was decreased(P<0.01), and the expression of COX-2 and VEGF at mRNA and protein levels was also significantly decreased in a dose-dependent manner(P<0.01). The expression of COX-2 was positively correlated with that of VEGF(P<0.05), and a positive correlation between the expression of COX-2 and P53 protein(P<0.05) was also observed.CONCLUSIONEOS may play its antitumor effect by inhibiting the expression of P53, COX-2 and VEGF in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z.

    Oratosquillaoratoria; Nasopharyngeal neoplasms; Protein P53; Cyclooxygenase 2; Vascular endothelial growth factors

    R739.6

    A

    10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-035

    1000-4718(2011)02-0390-04

    2010-07-08

    2010-10-12

    湛江市科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(No.2009C3101011);廣東醫(yī)學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目(No.XQ0502)

    △通訊作者 Tel:0759-22896311; E-mail: 13828283890@139.com

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