低氧培養(yǎng)小鼠肝細胞膜蛋白的蛋白質(zhì)組學研究

孫魯寧, 張靜萍, 孫 嬌, 張海鵬△

(中國醫(yī)科大學 1病理生理學教研室，2附屬第二醫(yī)院手術(shù)室, 遼寧 沈陽 110001)

低氧培養(yǎng)小鼠肝細胞膜蛋白的蛋白質(zhì)組學研究

孫魯寧1, 張靜萍2, 孫 嬌1, 張海鵬1△

(中國醫(yī)科大學1病理生理學教研室，2附屬第二醫(yī)院手術(shù)室, 遼寧 沈陽 110001)

目的采用蛋白質(zhì)組學方法研究低氧條件下培養(yǎng)小鼠肝細胞膜蛋白表達的變化情況并探討其病理生理學意義。方法直接消化法分離C57BL/6小鼠肝細胞，于低氧條件下(5% CO2, 4.5 mg/L O2)培養(yǎng)8 h后提取膜蛋白，然后采用雙向電泳法分離差異表達的蛋白，凝膠銀染后切取差異蛋白點進行MALDI-TOF 質(zhì)譜檢測，對獲取的數(shù)據(jù)采用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索，并采用Western blottng方法驗證差異蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧組小鼠肝細胞膜蛋白圖譜中有28個蛋白點表達量與對照組有顯著差異(P<0.05)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果，鑒定了低氧時低表達的膜蛋白9個和低氧時高表達的膜蛋白7個。Western blotting驗證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學分析一致。結(jié)論低氧時，抑素、細胞色素b-c1復合體亞單位1和血紅素結(jié)合蛋白p22HBP可能在細胞感受外界環(huán)境的氧變化及隨后的細胞內(nèi)低氧信號傳遞的過程中起到了非常重要的作用。

低氧; 肝細胞; 膜蛋白質(zhì); 蛋白質(zhì)組

氧為大多數(shù)生物生命活動所必需。當外環(huán)境的氧分壓降低時，機體內(nèi)部會迅速產(chǎn)生一系列病理生理反應以適應缺氧并預防和減少缺氧性損傷的發(fā)生，但細胞如何感受缺氧并啟動相應的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑使機體對該刺激做出反應的具體機制目前尚不明確[1,2]。很多學者認為細胞存在氧感受器，相關的研究也表明脯氨酸羥化酶2(prolyl-hydroxylase，PHD2)[3]、鐵蛋白(ferroprotein)[4]、血紅素(heme)[5]、血紅素氧合酶2(hemoxygenase 2，HO2)[6]等都可以感受細胞周圍環(huán)境氧分壓的變化。從靶效應的結(jié)果看，它們能相互協(xié)調(diào)地對缺氧刺激進行應答，但是在缺氧反應中，這些氧感受器之間的交互作用及其機制還缺乏整體研究。細胞膜位于細胞的最外層，是將細胞與外界環(huán)境隔開的屏障，也是細胞接受外界環(huán)境信號的感應器。膜蛋白在細胞表面識別、信號轉(zhuǎn)導、酶活性和物質(zhì)運輸方面都扮演著重要的角色，因而，有理由認為部分膜蛋白能夠感受外界環(huán)境的缺氧刺激并將該信號傳至細胞內(nèi)，進而使機體從整體上對缺氧作出反應。然而，有關膜蛋白的研究進展一直都很緩慢。為此，我們通過從整體上比較低氧組和對照組小鼠肝細胞膜蛋白表達譜的差異,以期尋找與低氧感受和反應相關的關鍵膜蛋白質(zhì)。

材 料 和 方 法

1肝細胞培養(yǎng)

直接消化法分離C57BL/6小鼠肝細胞進行原代培養(yǎng)。頸椎脫臼法處死小鼠，消毒后迅速取出肝臟并用眼科剪剪碎，向其中加入10倍肝組織體積的0.2% Ⅳ型膠原酶，封口，4 ℃冰箱過夜。 第2 d將消化完全的懸液經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾后，加入含10%新生牛血清的DMEM，4 ℃冰箱中靜置20 min后，離心3 次(300×g, 4 min)。 收集肝細胞于培養(yǎng)瓶中，進行臺盼藍活細胞計數(shù)，最后加入完全培養(yǎng)基, 調(diào)整肝細胞密度至5×108cells/L，分別于低氧(37 ℃、 5% CO2、4.5 mg/L O2)和常氧(37 ℃、5% CO2、 8.5 mg/L O2)條件下培養(yǎng)8 h。

2膜蛋白提取

使用ProteoExtract?天然膜蛋白抽提試劑盒(Merck Chemicals)依照產(chǎn)品說明書的方法提取肝細胞膜蛋白。首先在肝細胞中加入2 mL washing buffer，混勻后4 ℃離心2次(300×g，10 min)棄上清后加入10 μL蛋白酶抑制劑和2 mL extraction buffer Ⅰ，混勻后4 ℃孵育10 min。離心(16 000×g, 30 min)棄上清后加入5 μL蛋白酶抑制劑和1 mL extraction buffer Ⅱ，離心(16 000×g, 30 min)，提取膜蛋白，然后進行超濾濃縮。使用蛋白質(zhì)分析反應劑(Bio-Rad laboratories)進行蛋白定量分析后，-80 ℃保存。

3雙向凝膠電泳

取出-20 ℃保存的樣品水化緩沖液(8 mol/L urea, 2%CHAPS, 18 mmol/L DTT, 0.5% carrier ampholyte pH3-10NL)250 μL，室溫融化后，加入100 μg樣品中充分混勻，沿著聚焦盤的邊緣由左至右線性連貫地加入樣品溶液，去除IPG膠條(GE healthcare)上的塑料保護層，膠面朝下置于聚焦盤中的樣品溶液上，在每根膠條上覆蓋2 mL IPG覆蓋油，然后將聚焦盤放入電泳儀(GE company, Ettan IPG phor/Ⅱ)，進行等電聚焦。30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h，500 V 4 h。電泳溫度20 ℃以下，濕度38%左右。等電聚焦結(jié)束后，迅速將IPG膠條先后置于2 mL平衡緩沖液A[6 mol/L urea，0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)，2% SDS，30%甘油，痕量溴酚藍]和B [6 mol/L urea，0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)，2% SDS， 30%甘油，痕量溴酚藍]中各平衡15 min, 然后進行第2向SDS-PAGE電泳。將IPG膠條置于12.5%垂直SDS膠面上，進行電泳(15 mA/膠 30 min，30 mA/膠 3.5 h)，最后將跑好的膠移至染色盒里固定過夜，銀染45 min；水洗3 min 3次；顯色5 min；終止15 min。

4凝膠圖像獲取與軟件分析

銀染顯色的凝膠通過GS-710光密度掃描儀(Bio-Rad laboratories)獲取圖像，Imagemaster 5.0(GE healthcare)進行分析統(tǒng)計，根據(jù)3次重復實驗的2D圖譜，得到合乎統(tǒng)計學標準的蛋白質(zhì)差異點。

5蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解

將上述蛋白質(zhì)差異點用2D 全自動斑點切取系統(tǒng) Ettan Spotter Picker(Amersham Pharmacia)切膠，置于96孔板中，加入200 μL脫色液(0.1 mol/L硫代硫酸鈉和0.03 mol/L鐵氰化鉀溶液按照1∶1混合而成)脫色，再加入200 μL乙腈脫水干燥，冷凍抽干。測序級的胰蛋白酶用0.02 mol/L碳酸氫銨溶液配制為濃度12.5 μg/L后，加入膠粒中，4 ℃靜置30 min使膠粒完全泡脹。然后置于37 ℃控溫箱內(nèi)保溫20 h。酶解后的膠粒用0.1%TFA和50%乙腈提取肽段，抽干濃縮。

6質(zhì)譜分析與蛋白數(shù)據(jù)庫檢索

5 μL 1‰ TFA溶解肽段干粉后，與等體積飽和基質(zhì)溶液(HCCA，5 g/L)混合,點樣至樣品靶上。室溫干燥后裝靶測定,正離子模式下在Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFT Mass Spectrometer質(zhì)譜儀上反射檢測(飛行管長2.7 m，加速電壓20 kV，反射電壓23 kV)獲取數(shù)據(jù)。質(zhì)譜峰的質(zhì)量準確度以胰酶的自切峰為內(nèi)標進行校正。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Mascot軟件在NCBInr 20071130(5678482 sequences; 1961803296 residues)數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行檢索。

7Westernblotting檢測小鼠肝細胞膜蛋白抑素、血紅素結(jié)合蛋白p22HBP和細胞色素b-c1復合體的表達

取40 μg膜蛋白，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉該膜37 ℃ 1 h，再加入抑素、血紅素結(jié)合蛋白p22HBP和細胞色素b-c1復合體的抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜。經(jīng)ECL顯影后，用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(Chemiimager 5500 ALPHA INNOTECH USA)分析灰度值。

8統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1膜蛋白差異表達

低氧和對照組小鼠肝細胞膜蛋白雙向凝膠電泳凝膠銀染后檢測到的蛋白點見圖1。用Image Master 軟件對低氧和對照組小鼠肝細胞膜蛋白圖譜進行分析比較，發(fā)現(xiàn)低氧組小鼠肝細胞膜蛋白圖譜中有28個蛋白點表達量與對照組有顯著差異(P<0.05),見圖2。其中20個蛋白點表達量低氧組低于對照組(P<0.05)，8個蛋白點表達量低氧組高于對照組(P<0.05)。

Figure 1. Two-dimensional electrophoresis analysis of hepatic cell membrane proteins of hypoxic mice and the control(silver staining).A:hypoxia; B:control.

Figure 2. Differentially expressed hepatic cell membrane proteins of hypoxic mice and the control(green marked).

2差異蛋白鑒定

在凝膠上切取上述差異蛋白點進行MALTI-TOF質(zhì)譜檢測(有2個蛋白點沒有切到)，對獲取的數(shù)據(jù)采用Mascot軟件在NCBInr 數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索。結(jié)果顯示，其中16個蛋白點有肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting，PMF) 可信搜庫結(jié)果,見表1。8個蛋白點有PMF圖，但無可信搜庫結(jié)果，還有2個蛋白點無PMF圖。已鑒定的膜蛋白質(zhì)中，低氧時低表達9個，高表達7個(4個蛋白點為同一種未知蛋白)，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；抑素、細胞色素b-c1復合體亞單位1和血紅素結(jié)合蛋白p22HBP可分布于細胞膜，為本文重點討論的3種肝細胞膜蛋白，其余均為線粒體膜蛋白。

3Westernblotting檢測小鼠肝細胞膜蛋白抑素、血紅素結(jié)合蛋白p22HBP和細胞色素b-c1復合體的表達

低氧時小鼠肝細胞膜蛋白抑素和細胞色素b-c1復合體較對照組表達增多，且差異顯著(P<0.05);血紅素結(jié)合蛋白p22HBP較對照組表達減少，差異顯著(P<0.05)，見圖3。

討 論

我們采用蛋白質(zhì)組學的研究技術(shù)從整體上觀察了低氧條件下培養(yǎng)小鼠肝細胞膜蛋白表達的變化，其中抑素、細胞色素b-c1復合體亞單位1和血紅素結(jié)合蛋白p22HBP可能在細胞感受外界環(huán)境的氧變化及細胞內(nèi)低氧信號傳遞過程中起到了非常重要的作用；當?shù)脱跣盘杺鬟f至線粒體時，線粒體膜蛋白質(zhì)可進一步調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化等生理過程，使細胞對缺氧作出反應。此外，我們還發(fā)現(xiàn)低氧時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29的表達也上調(diào)，提示它可能也參與細胞低氧反應的調(diào)節(jié)機制。在這里我們著重探討細胞膜蛋白質(zhì)在缺氧反應中的作用。

表1 低氧和對照組小鼠肝細胞差異表達的膜蛋白

Figure 3. Expression of prohibitin, p22HBP and cytochrome b-c1 of hypoxia mice and the control by Western blotting.±s. n=8. ▲P<0.05 vs control.

抑素廣泛分布于細菌、植物、酵母、原蟲及哺乳類等各種生物細胞中, 其氨基酸結(jié)構(gòu)非常保守，且具有高度同源性[7]。現(xiàn)已證明，抑素既可以位于細胞膜上[8]，也可以位于線粒體[9]，還可以位于細胞核內(nèi)[10]，它在細胞增殖、凋亡、老化等過程中都發(fā)揮著非常重要的作用。Muraguchi等[11]的研究表明低氧時抑素可以通過穩(wěn)定線粒體膜電位，減少細胞色素C的釋放，從而對心肌細胞起到保護作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，抑素可以拮抗外源性H2O2誘發(fā)的細胞損傷[12],這些結(jié)果都提示抑素與外環(huán)境氧變化時細胞的調(diào)節(jié)機制有關。而且更為有趣的是，在上述研究中還觀察到，細胞膜抑素的表達水平在加入H2O2后3 h即達高峰,而線粒體抑素的表達水平在6 h后才開始增加。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，低氧條件下培養(yǎng)小鼠肝細胞8 h后，提取的膜蛋白中抑素水平已達常氧時的2.5 倍以上，推測此時增加的絕大多數(shù)應為細胞膜上的抑素。目前對抑素在線粒體內(nèi)的作用研究較多，認為其主要是作為分子伴侶，它的天然底物包括細胞色素C氧化酶I，線粒體氧化呼吸鏈復合體I等，抑素對這些蛋白的降解和組裝起到調(diào)節(jié)作用，但是細胞膜上的抑素如何發(fā)揮作用，它是否可以感受外界環(huán)境中的氧變化并將該信號傳遞至細胞內(nèi)，尚未見報道。低氧條件下，細胞膜和線粒體抑素水平依次增加的現(xiàn)象提示其在細胞感受外界環(huán)境氧變化和相關的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導及低氧時細胞內(nèi)的調(diào)節(jié)機制中可能發(fā)揮了非常重要的作用，這個推測還需要進一步的實驗結(jié)果證實。

血紅素涉及廣泛的基本細胞活動，例如參與呼吸鏈的電子傳遞、血液中的氧氣運輸。血紅素還可以直接作用于紅細胞特異性真核細胞翻譯起始因子2α激酶(erythroid-specific eukaryotic initiation factor 2α kinase)，通過全面調(diào)控紅細胞中的蛋白表達水平使細胞對外界環(huán)境的氧變化作出反應，從而間接起到氧感受器的作用[13]。但是血紅素為疏水性的，它必須與其它蛋白或生物大分子結(jié)合在一起才可以在血液中發(fā)揮正常作用。P22HBP是一個22kD的蛋白質(zhì)，最初由Taketani等[14]從小鼠肝細胞提取物中純化出來并鑒定為細胞內(nèi)的血紅素結(jié)合蛋白。雖然它的具體作用還不明確，但是有研究發(fā)現(xiàn)p22HBP是現(xiàn)已明確的與血紅蛋白生物合成有關的蛋白復合體的組成成分，認為它可能作為血紅素的載體或分子伴侶將之插入血紅蛋白中，或者將血紅素運輸?shù)骄€粒體中使之正常發(fā)揮作用[15]。通常認為p22HBP只存在于細胞質(zhì)中，且在低氧時表達增高。但出乎意料的是，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)p22HBP可分布于細胞膜，且低氧時細胞膜上p22HBP的表達要低于常氧的1.5倍以上，重復3次實驗均得到同樣結(jié)果。是否細胞膜與胞質(zhì)中的p22HBP存在不同作用，抑或它在低氧時可以脫離胞膜進入胞質(zhì)參與細胞的缺氧反應，還需要進一步的實驗加以證實。

細胞色素 b-c1 復合體，或稱線粒體呼吸鏈膜蛋白復合體Ⅲ(簡稱線粒體復合體III, EC1.10.2.2)，也叫細胞色素C還原酶(cytochrome C reductase)，是一個多亞基的膜蛋白復合體，分布于線粒體膜、線粒體電子傳遞鏈和細胞膜。目前，該復合體11個亞單位的完整2.8? 晶體結(jié)構(gòu)都已明確[16]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，低氧時細胞色素 b-c1 復合體亞單位1為常氧時的1.5倍以上，該亞單位與線粒體蛋白線粒體加工肽酶(mitochondrial processing peptidase，MPP)β亞單位有34%的同源性，并且Taylor等[17]的研究進一步證實了二者空間結(jié)構(gòu)上的相似性。大部分核基因編碼的線粒體蛋白質(zhì)首先在胞質(zhì)內(nèi)合成為帶有1段信號序列的前體蛋白，該信號序列可將前體蛋白轉(zhuǎn)送入線粒體，因而被稱為前導肽。前導肽作為一個識別信號與位于線粒體外膜上的受體蛋白相結(jié)合，并通過聯(lián)系了內(nèi)外膜的一個通道進入線粒體基質(zhì)。然后，在線粒體加工肽酶的作用下，前體蛋白的前導肽被水解后成為成熟型蛋白質(zhì)定位于線粒體的不同部位，進一步發(fā)揮各自的作用。細胞色素b-c1復合體亞單位1與線粒體加工肽酶的同源性提示其除可以傳遞電子外，還可能參與線粒體蛋白的加工過程。缺氧時它的表達增加是否有助于機體對缺氧的適應性反應還有待于進一步研究。

線粒體是細胞利用氧氣的最終場所, 缺氧時其電子傳遞和氧化磷酸化過程減弱，因而線粒體很早就被認為是細胞感受外環(huán)境中氧分壓變化的潛在場所之一，但其具體機制迄今尚不明確。我們的實驗觀察到低氧時胍基丁胺脲水解酶、氨基甲酰磷酸合成酶、谷胱甘肽過氧化物酶、乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶、?；o酶A脫氫酶、3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶等的表達均明顯降低，它們對細胞缺氧反應的具體影響機制還需深入研究。

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Proteomicstudyonmicehepaticcellmembraneproteinsafterexposedtohypoxia

SUN Lu-ning1, ZHANG Jing-ping2, SUN Jiao1, ZHANG Hai-peng1

(1DepartmentofPathophysiology,2OperatingRoomofTheSecondAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:hpzhangsq@yahoo.com.cn)

AIM: To identify the differential expression of mice hepatic cell membrane proteins after hypoxic exposure.METHODSThe hepatic cells of C57BL/6 mice were cultured for 8 h under hypoxic or normoxic conditions and the membrane proteins were extracted. The differentially expressed membrane proteins were separated by two-dimensional electrophoresis. The technique of matrix-assisted laser desorption/ionization mass time-of-flight spectrometry(MALDI-TOF-MS) was used to analyze the proteins.RESULTSCompared with the proteins extracted from the cells under normoxic condition with a threshold of 1.5-fold, 28 differentially expressed proteins were identified in the proteins extracted from the cells under hypoxic condition according to the database NCBInr 20071130, in which 9 were down-regulated and 7 were up-regulated, including prohibitin, cytochrome b-c1 complex subunit 1 and p22HBP.CONCLUSIONThe results suggest that prohibitin, cytochrome b-c1 complex subunit 1 and p22HBP might play important roles in sensing of cellular oxygen and the related signal transduction pathways.

Hypoxia; Hepatocytes; Membrane protein; Proteome

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-024

1000-4718(2011)02-0338-05

2010-07-08

2010-11-15

國家自然科學基金資助項目(No.30271444)

△通訊作者 Tel： 024-23256666-5308; E-mail: hpzhangsq@yahoo.com.cn