高脂飲食導(dǎo)致大鼠肝臟胰島素抵抗的作用機(jī)制研究*

李蘭芳, 郭 玉, 唐國(guó)濤, 曹 軒, 喻翠云, 陳臨溪

(南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001)

高脂飲食導(dǎo)致大鼠肝臟胰島素抵抗的作用機(jī)制研究*

李蘭芳, 郭 玉, 唐國(guó)濤, 曹 軒, 喻翠云, 陳臨溪△

(南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001)

目的本研究旨在建立SD大鼠胰島素抵抗模型,觀察高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠肝臟中氧化應(yīng)激以及胰島素抵抗的發(fā)生，分析胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下活性氧(ROS)的變化，初步探討ROS的主要來源。方法以高脂飼料喂養(yǎng)6只4周齡雄性SD大鼠12周，建立大鼠胰島素抵抗模型。用優(yōu)越血糖儀以電子感應(yīng)法測(cè)定血糖，放射免疫法檢測(cè)血清胰島素水平。二氫乙啶(DHE)染色觀察肝臟組織中的ROS水平。Western blotting檢測(cè)NADPH氧化酶3(NOX3)的表達(dá)。結(jié)果以高脂飼料喂養(yǎng)12周后，大鼠空腹血糖水平略有上升，但與對(duì)照組的大鼠相比無顯著差異，而胰島素敏感指數(shù)降低。蒽酮法的檢測(cè)結(jié)果顯示高脂飼料喂養(yǎng)大鼠肝組織糖原含量顯著降低，高脂飲食大鼠肝組織中NOX3的表達(dá)顯著增加，DHE染色顯示肝組織ROS水平顯著增加，提示ROS在肝胰島素抵抗發(fā)生中起重要作用。結(jié)論高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠胰島素敏感指數(shù)降低，肝組織中NOX3表達(dá)和ROS水平顯著增加，糖原含量顯著降低。

胰島素抵抗; NADPH氧化酶; 氧化性應(yīng)激

糖尿病是以血漿中葡萄糖(簡(jiǎn)稱血糖)水平升高為主要特征的代謝性疾病。而引起血糖升高的病理生理機(jī)制主要是胰島素分泌缺陷和(或)胰島素作用缺陷(胰島素抵抗)。胰島素抵抗是由遺傳和環(huán)境因素導(dǎo)致的，表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)胰島素生理作用的反應(yīng)性降低，即胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取作用受損，導(dǎo)致代償性胰島素分泌增多，其重要標(biāo)志為高胰島素血癥，具體表現(xiàn)為外周組織對(duì)胰島素敏感性下降,以及對(duì)葡萄糖的利用障礙。胰島素抵抗主要發(fā)生在脂肪、肝臟和骨骼肌，因?yàn)檫@些組織的細(xì)胞含有大量的胰島素受體，它們能結(jié)合胰島素從而在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要作用。

在胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制中，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是其中最為重要的機(jī)制。2004 年在美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)年會(huì)上就有學(xué)者提出了胰島素抵抗的統(tǒng)一發(fā)病機(jī)制，認(rèn)為共同基礎(chǔ)就是氧化應(yīng)激[1]。2004年歐洲糖尿病研究學(xué)會(huì)也提出共同土壤學(xué)說，認(rèn)為胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病都有共同發(fā)生機(jī)制，即氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是上述疾病發(fā)生的共同土壤。氧化應(yīng)激在胰島素抵抗中的作用以及抗氧化的治療已成為胰島素抵抗和2型糖尿病防治的重要研究方向[2]。雖然研究已證實(shí)氧化應(yīng)激在胰島素抵抗發(fā)生中起著重要的作用，但是氧化應(yīng)激在肝臟胰島素抵抗中的具體作用機(jī)制還有很多問題有待更進(jìn)一步地深入研究和探討。本研究旨在通過喂養(yǎng)高脂飼料，建立SD大鼠胰島素抵抗模型。觀察肝臟胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下氧化應(yīng)激的水平，分析胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下活性氧(reactive oxygen species, ROS)的變化，明確ROS的來源，初步探討NADPH氧化酶3(NOX3)在肝細(xì)胞胰島素抵抗中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

肌、肝糖原檢測(cè)試劑盒(南京建成生物試劑公司),活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天)，Electro-chemical luminescence 免疫印跡試劑盒(Amersham Pharmacia)[125I] radioimmunoassay kit(Insulin)(Linco)，dihydroethidium(DHE,Sigma)，羊抗NOX 3抗體(A-12)(SC-34699) (Santa Cruz)，actin(I-19)(sc-1616) (Santa Cruz)，兔抗山羊IgG(H+L)(北京中杉金橋)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 高糖高脂喂養(yǎng)4周齡雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)以建立胰島素抵抗動(dòng)物模型。將大鼠隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組(6只)給予普通飼料喂養(yǎng)；高脂喂養(yǎng)大鼠(6只)給予的飼料為普通飼料中添加20%脂肪(豬油和蛋黃粉等份)和20%蔗糖。喂養(yǎng)12周后，稱體重后斷尾法留取空腹血標(biāo)本，取血測(cè)定空腹血糖濃度和血清胰島素水平，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)。

2.2血清標(biāo)本的采集 斷尾法留取空腹血標(biāo)本，離心后分離血清，將血清樣品放入-20 ℃低溫冰箱中保存，供以后測(cè)定時(shí)使用。

2.3肝臟組織標(biāo)本的采集 將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后開始手術(shù)。采用腹中切口進(jìn)入腹腔，充分暴露手術(shù)視野。將獲取的肝臟組織標(biāo)本快速分別放入液氮中冷凍和4%甲醛液中固定。所有操作完成后將大鼠在麻醉狀態(tài)下采用氣胸法處死。

2.4指標(biāo)測(cè)定

①血糖 采用電子感應(yīng)法，用羅氏公司(Roche)的優(yōu)越血糖儀(ACCU-CHEK ADVANTAGE)測(cè)定。

②血清胰島素 采用放射免疫法測(cè)定(用大鼠標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，批內(nèi)變異<4%，批間變異<8%)。所有標(biāo)本同一批測(cè)定完成。

胰島素敏感指數(shù)計(jì)算(insulin sensitivity index, ISI)：測(cè)定空腹血糖和空腹血清胰島素后，按照公式 ln[1/(空腹血糖 × 空腹血清胰島素)]計(jì)算。

③肝組織糖原含量測(cè)定 按照肌、肝糖原檢測(cè)試劑盒的說明操作。樣本處理：收集細(xì)胞，稱重。按樣本重量(mg)：堿液體積(μL)=1∶3，一起加入試管中，沸水煮20 min，流水冷卻。將糖原水解液進(jìn)一步制備成糖原檢測(cè)液：肝糖原檢測(cè)液為1%，加蒸餾水的量為：細(xì)胞重量×100-細(xì)胞重量×4=細(xì)胞重量×96，混勻。按試劑盒說明將糖原檢測(cè)液與顯色劑混合，混勻后置沸水中煮5 min，冷卻后于620 nm波長(zhǎng)，1 cm光徑，空白管調(diào)零，測(cè)各管A值，計(jì)算糖原含量。

④肝組織內(nèi)ROS水平測(cè)定 取出液氮凍存的肝臟組織至-20 ℃平衡溫度后，OCT包埋制備成冰凍塊，用冰凍切片機(jī)以5 μm厚度連續(xù)切片。DHE原液用PBS按1∶1 000稀釋即為工作液，將沖洗切片用的PBS預(yù)冷。用PBS沖洗冰凍切片2-3次后，將DHE工作液滴加于冰凍切片上，室溫避光孵育15 min。PBS洗片，2 min×3次。50%甘油封片后熒光顯微鏡下觀察。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1高脂喂養(yǎng)大鼠體重變化

高脂喂養(yǎng)12周后稱體重(body weight, BW)，普通飼料喂養(yǎng)大鼠的BW為(576.33±29.36)g，而高脂喂養(yǎng)大鼠的BW為(602.43±46.18)g，體重比對(duì)照組略有增加但無顯著差異,見圖1。

Figure 1. The body weight of rats fed with high-fat diet(HF)..

2高脂喂養(yǎng)大鼠空腹血糖濃度變化

采用電子感應(yīng)法，測(cè)定大鼠空腹血糖濃度(fasting blood glucose, FBG)，正常飲食大鼠的FBG為(4.41±0.47)mmol/L，而高脂喂養(yǎng)大鼠的FBG為(6.17±1.65)mmol/L，較正常飲食組略有增加但無顯著差異,見圖2。

Figure 2. The levels of fasting blood glucose(FBG) in rats fed with high-fat diet(HF).±sE.n=6.

3高脂喂養(yǎng)大鼠空腹胰島素濃度變化

采用放射免疫法測(cè)定大鼠空腹血清中胰島素的濃度(fasting serum insulin, FSI)。高脂喂養(yǎng)12周后，大鼠空腹血清胰島素濃度增加。結(jié)果見圖3，正常飲食大鼠的FSI為(8.34±1.98) mU/L，而高脂喂養(yǎng)大鼠的FSI為(9.72±2.89) mU/L，較正常飲食組增加但無顯著差異。

Figure 3. The levels of fasting serum insulin(FSI) in rats fed with high-fat diet(HF). ±sE. n=6.

4高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素敏感指數(shù)降低

根據(jù)空腹血糖濃度和血清胰島素濃度，按照公式ln[1/(空腹血糖濃度×血清胰島素濃度)]計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)。結(jié)果如圖4所示，正常飲食大鼠的ISI為-3.85±0.57，而高脂喂養(yǎng)大鼠的ISI為-5.35±0.68，較正常飲食組顯著降低(P<0.05)，提示高脂喂養(yǎng)后大鼠胰島素敏感性降低，產(chǎn)生了胰島素抵抗。

Figure 4. Decreased insulin sensitivity index(ISI) in rats fed with high-fat diet(HF). ±sE. n=6. *P<0.05 vs control.

5高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟產(chǎn)生胰島素抵抗

通過計(jì)算ISI，提示大鼠產(chǎn)生了胰島素抵抗。而外周組織產(chǎn)生胰島素抵抗的主要是肝臟、脂肪和肌肉。進(jìn)一步觀察大鼠肝臟組織產(chǎn)生胰島素抵抗的情況。大鼠麻醉后處死，取新鮮肝臟組織，研磨后測(cè)定肝臟中的糖原含量。糖原合成降低是肝臟產(chǎn)生胰島素抵抗的重要標(biāo)志。高脂喂養(yǎng)12周后大鼠肝臟組織中糖原的含量為(13.75±2.22)mg/g,較正常飼料喂養(yǎng)對(duì)照組(23.60±3.76)mg/g顯著降低(P<0.05)，提示高脂喂養(yǎng)后大鼠肝臟組織產(chǎn)生了胰島素抵抗,見圖5。

Figure 5. Reduced glycogen content in liver tissues of rats fed with high-fat diet(HF). ±sE. n=6. *P<0.05 vs control.

6高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟的活性氧產(chǎn)生變化

將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后手術(shù)取肝臟組織標(biāo)本OCT包埋后快速分別放入液氮中冷凍，冰凍連續(xù)切片，DHE(1∶1 000稀釋)染色，免疫熒光顯微鏡下觀察(1/100 s曝光時(shí)間)肝臟組織的ROS水平。結(jié)果見圖6，高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟組織中的ROS水平較正常對(duì)照組顯著增加。

7高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟的NOX3表達(dá)水平

用Western blotting分析肝臟組織的NOX3表達(dá)水平。結(jié)果顯示高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟組織中NOX3的表達(dá)顯著升高,見圖7。

Figure 6. Elevated ROS generation in liver tissues of rats fed with high-fat diet(HF)(×200).

Figure 7. Increased expression level of NOX3 in liver tissues of rats fed with high-fat diet(HF).±sE. n=3.*P<0.05 vs control.

討 論

氧化應(yīng)激在胰島素抵抗和糖尿病發(fā)病中起重要作用。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)ROS生成增加和(或)清除能力降低，導(dǎo)致ROS生成和清除失衡。 ROS具有重要的生理學(xué)作用，但過量的ROS會(huì)引起分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷。胰島素抵抗是指胰島素敏感的外周組織及靶器官或靶組織，主要是肝臟、脂肪組織、骨骼肌對(duì)胰島素的敏感性及反應(yīng)性降低，導(dǎo)致正常量的胰島素產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)低于正常水平。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的主要環(huán)節(jié)，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，雖然進(jìn)行了大量研究，但至今其分子機(jī)制尚未完全闡明。氧化應(yīng)激在胰島素抵抗中的作用機(jī)制倍受關(guān)注。大量研究都表明在各種胰島素抵抗的動(dòng)物和細(xì)胞模型中氧化應(yīng)激水平上升，并且氧化應(yīng)激激活的信號(hào)通路也導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生和發(fā)展[3-5]。胰島素抵抗主要發(fā)生在脂肪、肝臟和骨骼肌[6]。

在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展過程中，產(chǎn)生氧化應(yīng)激的機(jī)制眾多，主要有：1)糖自氧化：葡萄糖自身氧化作用增加，產(chǎn)生大量的ROS；2)蛋白質(zhì)的非酶糖化：在非酶促條件下，葡萄糖和蛋白質(zhì)相互作用形成 Amadori 產(chǎn)物，然后再形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)，AGEs通過與其受體RAGEs結(jié)合，促進(jìn)ROS形成;3)多元醇通路的活性增高：醛糖還原酶多元醇代謝途徑的活化，可降低 NADPH/NADP+，增加NADH/NAD+比例，消耗還原型GSH，從而誘導(dǎo)ROS合成[7,8]；4)蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的活化：激活PKC，進(jìn)而活化細(xì)胞NOX，誘導(dǎo)ROS的合成以及隨后的脂質(zhì)過氧化。反過來ROS也活化PKC，從而使ROS的產(chǎn)生進(jìn)一步增加；5)抗氧化系統(tǒng)清除能力減弱：SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性降低，維生素 C、維生素 E、GSH等抗氧化劑水平下降，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，明顯削弱了機(jī)體清除ROS的能力。由此可見胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展過程中ROS產(chǎn)生增多和抗氧化能力減弱二者并存，從而發(fā)生氧化應(yīng)激[9,10]。

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)的大鼠胰島素敏感性降低，產(chǎn)生明顯的胰島素抵抗。而同時(shí)，大鼠肝臟組織也產(chǎn)生了胰島素抵抗，其特點(diǎn)就是肝糖原含量顯著降低，而肝臟的氧化應(yīng)激水平升高。提示高脂喂養(yǎng)后的大鼠產(chǎn)生了胰島素抵抗，并且高水平的氧化應(yīng)激，進(jìn)一步加重肝臟胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。目前的研究認(rèn)為ROS產(chǎn)生的途徑有多種，肝細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要酶體包括：NOX、線粒體電子傳遞鏈酶復(fù)合體、去偶聯(lián)的一氧化氮合酶、黃嘌呤氧化酶等。其中NOX是肝細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要來源，NOX家族的分布具有組織特異性，最早在吞噬型細(xì)胞(粒性白細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)了NOX2，后來又在各種組織和器官中發(fā)現(xiàn)新的同工酶，分別命名為NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2，它們均包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和血紅素、NADPH、FAD結(jié)合位點(diǎn)。NOX是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要途徑之一。NOX主要還包括5個(gè)亞組分: p22phox、p47phox、p67phox、Rac1以及gp91phox。p22phox和gp91phox為膜蛋白，在中性粒細(xì)胞分泌小泡或特異的顆粒膜表面形成異源二聚體， 即細(xì)胞色素b558。NADPH的電子就是通過它的2種輔基由黃素蛋白FAD經(jīng)血紅素轉(zhuǎn)移到O2上的[11，12]。肝臟主要表達(dá)NOX3及其亞組分p22phox、p47phox、p67phox和Rac1。NOX3是肝臟細(xì)胞中主要的NADPH氧化酶[13]。高脂飲食后，大鼠肝臟組織中NOX3的表達(dá)顯著增加，提示NOX被激活，從而產(chǎn)生大量ROS，促進(jìn)肝臟組織的氧化應(yīng)激。我們的研究結(jié)果表明NOX源性的ROS在肝臟組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激和胰島素抵抗中可能發(fā)揮了重要作用，但NOX源性ROS導(dǎo)致胰島素抵抗的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入探討。

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Mechanismofhepaticinsulinresistanceinducedbyhigh-fatdiet

LI Lan-fang, GUO Yu, TANG Guo-tao, CAO Xuan, YU Cui-yun, CHEN Lin-xi

(InstituteofPharmacyandPharmacology,NanhuaUniversity,Hengyang421001,China.E-mail:chenlinxi@tom.com)

AIM: To observed the relationship between oxidative stress and development of insulin resistance in hepatic tissues of Sprague dawley(SD) rats by analyzing reactive oxygen species(ROS) level and NADPH oxidase 3(NOX3) expression in livers.METHODSFour-week-old male SD rats were fed with high-fat diet containing 20% fat and 20% sucrose for 12 weeks to induce insulin resistance. Plasma insulin level was detected by radioimmunoassay. The content of liver intracellular glycogen was measured using a glycogen assay kit. ROS generation in the liver tissues was assessed by dihydroethidium(DHE) fluorescence. The expression of NOX3 was determined by Western blotting.RESULTSAfter 12 weeks of high-fat diet feeding, the content of blood glucose was increased but still maintained in normal level in the rats. However, the index of insulin sensitivity obviously decreased. Hepatic glycogen content in the rats fed with high-fat diet was significantly decreased, indicating that insulin resistance developed. Enhanced ROS production in hepatic tissues of the rats fed with high-fat diet was observed. Importantly, the expression of NOX3 in the liver was up-regulated in response to high-fat dietinvivo.CONCLUSIONHigh-fat diet feeding decreases insulin sensitivity, enhances ROS level and NOX3 expression, and reduces glycogen content in the livers.

Insulin resistance; NADPH oxidase; Oxidative stress

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-019

1000-4718(2011)02-0310-05

2010-08-05

2010-11-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30901577);湖南省衡陽市科技局資助項(xiàng)目(No.2009KJ14)

△通訊作者 Tel:0734-8281408;E-mail:chenlinxi@tom.com