胃癌術(shù)前適形放療的蛋白表達(dá)譜變化及意義*

蔣明東, 李少林, 仝蜀生, 李鐵軍, 王正洪, 趙 瑜, 黃小波, 徐永柱

(重慶市第九人民醫(yī)院 1腫瘤血液科并放療中心,3普外科,重慶400700；2重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院放射教研室，重慶400016; 4重慶市衛(wèi)生信息中心,重慶400014)

胃癌術(shù)前適形放療的蛋白表達(dá)譜變化及意義*

蔣明東1, 李少林2, 仝蜀生3, 李鐵軍3, 王正洪1, 趙 瑜1, 黃小波1, 徐永柱4△

(重慶市第九人民醫(yī)院1腫瘤血液科并放療中心,3普外科,重慶400700；2重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院放射教研室，重慶400016;4重慶市衛(wèi)生信息中心,重慶400014)

目的探討胃癌術(shù)前適形放療作用后的蛋白表達(dá)譜變化及意義。方法選擇有病理診斷的胃癌患者，隨機(jī)分組行單純手術(shù)和適形放療+手術(shù)，術(shù)后收集腫瘤組織標(biāo)本。以固相pH 梯度等電聚焦(IPG-IEF) 為第一向、垂直平板十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 為第二向進(jìn)行胃癌組織蛋白質(zhì)分離；用圖像分析軟件 PDQuest 8.0 分析電泳圖譜，尋找有意義的差異蛋白點(diǎn)；運(yùn)用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，并對其中差異顯著蛋白采用Western blotting 和RT-PCR進(jìn)行鑒定，檢測蛋白表達(dá)譜變化。結(jié)果胃癌適形放療組與對照組的蛋白表達(dá)譜明顯不同，發(fā)現(xiàn)3個(gè)有意義的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，適形放療組腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、c-erbB-2和表皮生長因子受體(EGFR)的表達(dá)降低，與對照組比較差異顯著(P<0.01)。結(jié)論胃癌術(shù)前適形放療可以降低胃癌細(xì)胞相關(guān)表皮蛋白表達(dá)。這些蛋白可能成為胃癌治療新的靶點(diǎn)。

胃腫瘤； 蛋白質(zhì)組

胃癌臨床治療以外科手術(shù)為首選，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，在進(jìn)展期和中晚期胃癌患者更為突出[1,2]。因此，尋找更加有效的聯(lián)合治療方案成為臨床醫(yī)生和醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究者追求的目標(biāo)。 三維適形放療(3-dimensional conformal radiation therapy，3D-DCRT)是一種提高治療的物理措施，通過適形放療能夠提高腫瘤的局部控制率進(jìn)而提高生存率[3,4]。目前3D-CRT已廣泛應(yīng)用于鼻咽癌、前列腺癌和肺癌等的臨床治療，比傳統(tǒng)放射治療有明顯的優(yōu)勢。本研究選3D-CRT術(shù)前放療胃癌病人，休息3-4周后進(jìn)行手術(shù)，采集術(shù)后胃癌組織，用蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測胃癌相關(guān)蛋白表達(dá)變化，以探討胃癌病人術(shù)前3D-CRT抑癌作用的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑和儀器 牛血清白蛋白(BSA) 蛋白定量檢測試劑盒(Bio Teke Corporation)，固相pH 梯度(IPG) 膠條(pH 4-7，17 cm，Bio-Rad)，尿素、硫脲(Sigma)，二硫蘇糖醇(Bio-Rad)，十二烷基磺酸鈉(SDS)、甘氨酸、丙烯酰胺、TEMED(美國Bio-Rad)。載體兩性電解質(zhì)、等電聚焦(IEF) 覆蓋液和低熔點(diǎn)瓊脂糖(Amersham Pharmacia)，乙腈(Bake)，三氟乙酸(Sigma)。凝膠/ 發(fā)光圖像分析系統(tǒng)ChemiDoc XRS和PDQuest 2D 圖像分析軟件(Bio-Rad)，三維適形放療治療計(jì)劃系統(tǒng)(3D-TPS)(Elekta)，6MV-直線加速器(Elekta)，雙螺旋CT(Siemens)，真空凍干機(jī)(Christ Alpha)，質(zhì)譜分析儀(ABI Voyager DE-Pro MALDI - TOF - MS)。

1.2病人資料 收集在本院2006年7月-2008年12月住院、臨床和病理診斷為胃癌的病例26例，其中男16例，女10例，年齡在45-72歲，平均年齡為58歲，Ⅲ-Ⅳ期，均系自愿入組并簽署相關(guān)知情同意書。隨機(jī)將患者分成2組，1組術(shù)前三維適形放療+手術(shù)為實(shí)驗(yàn)組，1組單純手術(shù)為對照組。收取病人手術(shù)后胃癌標(biāo)本，每個(gè)病例切下的瘤組織10 g，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)組處理 訓(xùn)練患者平靜呼吸，在真空墊及體模固定下作治療定位，雙螺旋CT增強(qiáng)掃描，3D-TPS制作優(yōu)化治療計(jì)劃并驗(yàn)證，對實(shí)驗(yàn)組胃癌患者進(jìn)行適形放療，標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)進(jìn)行[3,4]，總照射劑量40.0-48.0 Gy/20-24 f，放療結(jié)束后休息2-3周進(jìn)行手術(shù)治療(不因放療改變手術(shù)方案)。對照組行單純手術(shù)進(jìn)行。手術(shù)后對標(biāo)本進(jìn)行大體和組織形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)收集各組每個(gè)病例瘤組織10 g左右，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2標(biāo)本處理與定量 每個(gè)病例瘤組織分取1 g左右，冷PBS洗滌3次，棄上清，每管加入200 μL DIGE裂解緩沖液{7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基}丙磺酸內(nèi)鹽 ，0.2%固相pH 梯度(immobilized pH gradients，IPG)緩沖液，羅氏混合酶抑制劑]，冰浴超聲破碎(80 W，每次6 s，間隔10 s，共8次，置于冰上)，然后14 000 r/min離心1 h，收集上清液。使用牛血清白蛋白(BSA) 蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，將實(shí)驗(yàn)組和對照組蛋白樣品分裝于0.5 mL離心管中，-80 ℃低溫保存。

2.3雙向電泳(2-dimensional electrophoresis,2-DE) 2組胃癌組織蛋白質(zhì)上樣量均300 μg，2-DE操作參照Bio-Rad 公司2-DE 手冊進(jìn)行。

2.4凝膠染色并掃描 參照 Yan等[5]的銀染方案進(jìn)行染色。將染色后的凝膠利用 Image Scanner 光學(xué)掃描儀，掃描并備份凝膠圖像，再經(jīng) PDQuest 8.0 圖形分析軟件對 2 - DE 圖譜進(jìn)行分析，尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì)。挖取重復(fù)性和分辨率較好的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)準(zhǔn)備質(zhì)譜分析。

2.5質(zhì)譜分析 制備好的樣品用ABI公司的 Voyager DE-Pro MALDI - TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

2.6數(shù)據(jù)庫檢索 將獲得的肽質(zhì)量指紋譜數(shù)(http:∥www.prospector.ucsf.edu) 進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。參數(shù)采用PMF 中的肽片段質(zhì)量控制在800-3 000，酶解片段不完全選擇為1 個(gè)，肽片段分子量最大容許誤差控制在±1 D，半胱氨酸為脲甲基半胱氨酸(carbamidomethyl-Cys)，物種來源選擇人。

2.7Western blotting和RT-PCR鑒定差異表達(dá)蛋白 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和半定量 RT-PCR 按照常規(guī)方法進(jìn)行。磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)在多數(shù)人類細(xì)胞系中的表達(dá)是恒定的，故而用作半定量 RT-PCR 的內(nèi)參照。蛋白提取采用Qiagen試劑盒提取，上樣50 μg，Western blotting按常規(guī)進(jìn)行。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異用Student’st檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.5軟件完成。

結(jié) 果

1胃癌大體及組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

手術(shù)后取得的人胃癌組織大體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)組可見腫瘤表面部分呈灰白色或蒼白色表現(xiàn)，部分纖維變，整體有一定固縮變小；而對照組腫瘤表面呈高低不平的外凸，暗紅色表現(xiàn)，無纖維變。對照組低倍鏡(圖1A1)可見癌細(xì)胞浸潤生長，形成癌性腺體，高倍鏡(圖1A2)可見癌細(xì)胞沿腺體壁浸潤，大小不一；實(shí)驗(yàn)組低倍鏡(圖1B1)可見浸潤生長的癌細(xì)胞排列紊亂，癌性腺體固縮，高倍鏡(圖1B2)可見癌細(xì)胞體積變小，部分細(xì)胞呈空化變；實(shí)驗(yàn)組另一視野低倍鏡(圖1B3)可見腫瘤血管塌陷、閉塞，管腔內(nèi)可見血栓形成，高倍鏡(圖1B4)可見塌陷的腫瘤血管壁細(xì)胞固縮，體積變小。

Figure 1. Morphology of gastric cancer tissues in control and experimental groups. Cancer cells grew invasively and formed glands(arrow) in control group(A1, ×100; A2, ×400). Caner tissues in experimental group, with derangement(B1, ×100), shrinkages of cell size and carcinous glands(B2, ×400). Blood vessels in experimental group were destroyed with the occurrence of embolism(B3, ×100),and the cells of vessel walls were shrunk(B4, ×400).

2胃癌組織蛋白質(zhì)電泳圖結(jié)果比較

本實(shí)驗(yàn)所得電泳圖譜具有可重復(fù)性，蛋白質(zhì)點(diǎn)主要集中在 pH 4-7 區(qū)域，從左到右PI增加，縱向自上而下相對分子質(zhì)量減少。對得到的電泳圖運(yùn)用 PDQuest 8.0 軟件分析，檢測到的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)，對照組胃癌組織為 410個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，適形放療組胃癌組織為 378 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。由軟件自動選取差異大于2倍的斑點(diǎn)，兩組比較共發(fā)現(xiàn) 12個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，適形放療組胃癌組織3個(gè)蛋白點(diǎn)量上調(diào)，9個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)，其中3個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)明顯,見圖2。

3MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果

切下適形放療組與對照組胃癌組織的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行酶解，采用質(zhì)譜分析技術(shù)MALDI-TOF-MS 鑒定， 差異蛋白點(diǎn)的性質(zhì)見表1 。

4差異表達(dá)蛋白質(zhì)的歸類

經(jīng)過質(zhì)譜分析篩選共得到7個(gè)表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)，其中有2個(gè)差異蛋白點(diǎn)經(jīng)鑒定屬于同一種蛋白質(zhì)，因此最終得到6個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的胃癌組織表達(dá)差異蛋白點(diǎn)，與對照組比較差異顯著(P<0.01)，其中3個(gè)表達(dá)上調(diào)(以“+”號表示，未列出)，3個(gè)表達(dá)下調(diào)(以“-”號表示，見表1)。其中3個(gè)表達(dá)下調(diào)明顯的蛋白主要是與代謝酶類以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞表皮生長、細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的蛋白質(zhì)。

Figure 2. Differentially expressed protein spots in 2-dimensional electrophoresis image in gastric tumor tissues with(B) or without(A) conformal radiation therapy.

表1 經(jīng)MALDI - TOF質(zhì)譜技術(shù)鑒定的差異表達(dá)蛋白

5差異表達(dá)蛋白的RT-PCR及Westernblotting驗(yàn)證

RT-PCR檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)和c-erbB-2轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果顯示，三者在術(shù)前三維適形放療組胃癌組織中表達(dá)降低，而且部分胃癌組織表達(dá)缺失，見圖3A。Western blotting 結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，見圖3B。

討 論

放射治療不是胃癌的首選治療，但已有報(bào)道術(shù)前放療可使60%的胃癌不同程度地縮小，可提高手術(shù)切除率和治愈性切除率，使5年存活率提高10%-20%[2,5]。近年來3D-CRT的出現(xiàn)，更加擴(kuò)大了放療在惡性腫瘤治療中的應(yīng)用范圍。3D-CRT能夠極大地提高病灶靶區(qū)的放射劑量，同時(shí)病灶區(qū)周圍正常組織和器官得到最好的保護(hù)，因此3D-CRT成為臨床治療中晚期胃癌病人的有效姑息手段[3,6]。在本研究中，我們采用三維適形放射治療手段，對中晚期胃癌病人進(jìn)行術(shù)前治療，取得了一定的臨床治療優(yōu)勢：與對照組相比，病人術(shù)中出血減少，腫瘤塊均有一定縮小，手術(shù)時(shí)間縮短，術(shù)后恢復(fù)較快。術(shù)后的胃癌組織標(biāo)本大體(肉眼)觀察和組織形態(tài)學(xué)觀察也佐證了術(shù)前3D-CRT對胃癌的手術(shù)治療有著積極的作用，在胃癌的綜合治療中占有重要的地位。

Figure 3. The alteration proteins were detected by RT-PCR and Western blotting. A:RT-PCR;B:Western blotting.±s.n=3. *P<0.05 vs control group

我們選用比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究三維適形放射治療胃癌后的蛋白質(zhì)表達(dá)差異變化。蛋白質(zhì)組學(xué)是以整體蛋白質(zhì)作為研究對象，為尋找差異表達(dá)蛋白提供了一個(gè)全新的手段[7-10]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，術(shù)前三維適形放療組胃癌組織VEGF、EGFR和c-erbB-2蛋白表達(dá)降低，部分表達(dá)缺失，說明術(shù)前適形放療對胃癌病灶的作用可能部分是通過影響VEGF、EGFR和c-erbB-2因子及受體表達(dá)來完成的。

VEGF、EGFR和c-erbB-2是胃癌細(xì)胞的重要相關(guān)因子，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。VEGF是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中腫瘤血管生成的重要因子，c-erbB-2出現(xiàn)在胃黏膜癌變過程的后期，是胃黏膜惡性變的標(biāo)志，EGFR在胃癌發(fā)生發(fā)展中呈異常水平表達(dá)，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于術(shù)前3D-CRT的作用，胃癌細(xì)胞產(chǎn)生VEGF、EGFR和c-erbB-2蛋白差異表達(dá)，提示這些差異表達(dá)蛋白有可能成為未來胃癌治療的有效靶標(biāo)。

(致謝:蛋白質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容在中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所蛋白質(zhì)組分析研究中心完成，特此表示感謝!)

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Alterationandsignificanceofproteinexpressionprofileingastriccancerwithpreoperativeconformalradiationtherapy

JIANG Ming-dong1, LI Shao-lin2, TONG Shu-sheng3, LI Tie-jun3, WANG Zheng-hong1, ZHAO Yu1, HUANG Xiao-bo1, XU Yong-zhu4

(1DepartmentofOncologyandHematology,CenterofRadiotherapy,3DepartmentofOrdinarySurgery,TheNinthPeople’sHospitalofChongqingCity,Chongqing400700,China;2TeachingLaboratoryofRadiationforCollegeofPreclinicalMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;4ChongqingHealthInformationCenter,Chongqing400014,China.E-mail:xuyongzhu888@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the alteration and significance of the protein expression profile in gastric cancer with preoperative conformal radiation therapy.METHODSThe pathologically-diagnosed gastric cancer patients were randomly chosen to perform conformal radiation therapy before operation. The patients without conformal radiation treatment served as controls. The tumor tissues were collected after operation from the patients. The alteration of the protein expression profile was detected by 2-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF-MS. The expression of vascular endothelial growth factor(VEGF),c-erbB-2 and epidermal growth factor receptor(EGFR) was detected by RT-PCR and Western blotting.RESULTSCompared with the patients without conformal radiation therapy, the protein expression profile of tumor tissues from gastric cancer patients with conformal radiation therapy was obviously altered. The expression of VEGF, c-erbB-2 and EGFR was differentially reduced(P<0.01).CONCLUSIONThe preoperative accurate conformal radiation therapy reduces the expression of gastric cancer-related epithelial proteins, indicating new therapeutic targets for gastric cancer.

Stomach neoplasms; Proteome

R733.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-011

1000-4718(2011)02-0268-04

2010-08-02

2010-12-02

重慶市衛(wèi)生局科研基金資助項(xiàng)目(No.07-2-219)

△通訊作者 Tel：023-63635355; E-mail：xuyongzhu888@yahoo.com.cn