腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體參與雷帕霉素誘導血管內(nèi)皮細胞功能損傷的體外研究*

葉 盛， 張懷勤， 林以諾， 黃偉劍， 張艷麗， 邵小琳

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科, 心血管生物和基因研究所，浙江 溫州 325000)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體參與雷帕霉素誘導血管內(nèi)皮細胞功能損傷的體外研究*

葉 盛， 張懷勤△， 林以諾， 黃偉劍， 張艷麗， 邵小琳

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科, 心血管生物和基因研究所，浙江 溫州 325000)

目的探討雷帕霉素對內(nèi)皮細胞凋亡和增殖、遷移能力的影響，以及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)表達水平的變化。方法用濃度為0、1、10、100 μg/L 的雷帕霉素孵育內(nèi)皮細胞24 h，應用CCK8法檢測血管內(nèi)皮細胞的增殖能力，Transwell小室和劃痕試驗檢測細胞遷移能力，DAPI染色觀察凋亡細胞核形態(tài)改變，Western blotting法檢測caspase-3活性以顯示血管內(nèi)皮細胞的凋亡，并用 Western blotting檢測TRAIL在凋亡的內(nèi)皮細胞中的表達。結(jié)果雷帕霉素(1-100 μg/L)能誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡并抑制其遷移能力(P<0.01)。除雷帕霉素1 μg/L外， 10 μg/L和100 μg/L雷帕霉素均能抑制內(nèi)皮細胞增殖能力(P<0.01)，同時雷帕霉素(10-100 μg/L)使TRAIL蛋白表達增加,兩者作用均呈濃度依賴性(P<0.01)。結(jié)論雷帕霉素能誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡并抑制其增殖和遷移能力。TRAIL表達上調(diào)與雷帕霉素誘導血管內(nèi)皮細胞損傷有一定的相關(guān)性。

雷帕霉素; 內(nèi)皮細胞; 細胞凋亡; 細胞增殖; 細胞遷移; 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體

冠心病是危害人民健康的主要疾病之一，近年來經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI) 廣泛用于冠心病的非藥物治療，為冠心病患者帶來極大的獲益。但是支架的植入又帶來兩大棘手的問題。首先是支架內(nèi)血栓的形成。早期血栓問題已通過長期服用雙聯(lián)抗血小板藥物基本得到了解決。其次是支架內(nèi)再狹窄。由于PCI過程中球囊擴張及支架作為外源性異物的植入對血管內(nèi)皮的刺激，患者的冠脈往往出現(xiàn)內(nèi)膜過度增生而導致支架再狹窄。早期的金屬裸支架由于過高的再狹窄率(有報道約30%-50%)導致其使用受限，而以雷帕霉素洗脫支架為代表的藥物涂層支架能阻止細胞周期進展、有效抑制平滑肌細胞遷移、增殖和胞外基質(zhì)的合成，抑制血管內(nèi)膜增生，從而明顯減少支架內(nèi)再狹窄和臨床不良事件發(fā)生率；多支、復雜病變患者亦能夠從中獲益。然而雷帕霉素洗脫支架并不能完全解決支架所面臨的問題。雖然支架的藥物涂層(如雷帕霉素)能夠通過抑制平滑肌細胞及細胞外基質(zhì)合成從而抑制支架的再狹窄，但雷帕霉素也會抑制正常的內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮前體細胞在病變冠脈內(nèi)的再內(nèi)皮化，導致部分患者一旦停用氯吡格雷后會出現(xiàn)晚期支架內(nèi)血栓，同時它也會導致一定程度的冠脈內(nèi)皮功能不全、側(cè)枝功能受損，而不利于冠心病患者心肌血運的恢復[1-3]。如何解決支架表面的藥物涂層對周圍正常的內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮祖細胞的功能抑制，從而達到既能抑制支架再狹窄，又能保證血管的再內(nèi)皮化而防止血栓形成成為新時代藥物支架面臨的重點和難點。

血管內(nèi)皮是由單層內(nèi)皮細胞排列組成的血管床，也是血管壁與循環(huán)中血液及其它物質(zhì)的屏障。作為人體最大的內(nèi)分泌、旁分泌器官,及許多活性物質(zhì)的靶器官,它在調(diào)節(jié)血管收縮舒張狀態(tài)、維持凝血及纖溶系統(tǒng)平衡、抑制血小板聚集、抑制炎性細胞與血管內(nèi)皮細胞間的黏附以及調(diào)控血管平滑肌生長等方面有重要生理功能。因而內(nèi)皮細胞功能不全與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明高同型半胱氨酸血癥、熱休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)、非對稱二甲基精氨酸、20 羥基廿碳四烯酸、糖尿病、尿酸、高血壓、冠心病、吸煙、高齡及肥胖等均可影響內(nèi)皮功能[4-7]。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成員，它可以通過它的受體DR4和DR5選擇性誘導細胞凋亡，不僅在腫瘤組織的凋亡中發(fā)揮重要作用[8]，而且在某些疾病的病理性損傷修復中也起到一定作用，并且TRAIL誘導的細胞凋亡與caspase-3關(guān)系密切。Li 等[9]發(fā)現(xiàn)TRAIL的表達可致人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡，但是其是否在雷帕霉素誘導的內(nèi)皮細胞凋亡的過程中起作用還不甚清楚。本研究旨在明確TRAIL的表達是否存在與雷帕霉素誘導的內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡相關(guān)。

材 料 和 方 法

1材料和試劑

胎牛血清、0.05%胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS和Hanks液購自Gibco，雷帕霉素購自福建科瑞藥物有限公司，CCK-8細胞計數(shù)試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所，Transwell小室購自Corning，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自Invitrogen，活化caspase-3、TRAIL抗體購自Abcam， GAPDH抗體購自康成公司,ECL 化學發(fā)光顯色試劑盒購自Cell Signal。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) 本實驗采用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(購自ATCC)為研究對象，細胞生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中(Gibco)，含1%青-鏈霉素，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，雷帕霉素溶于DMSO，終濃度分別為1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L，細胞在無血清培養(yǎng)基孵育同步化48 h后，換無血清RPMI-1640、不同濃度雷帕霉素(1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L)繼續(xù)孵育24 h。

2.2實驗分組 分為4組:(1)正常對照組: 加入配制雷帕霉素的溶劑(0.01% DMSO);(2) 雷帕霉素各濃度干預組(共3組):分別用1、10、100 μg/L雷帕霉素(含0.01%DMSO RPMI-1640培養(yǎng)基)與內(nèi)皮細胞共同孵育24 h。

2.3細胞增殖能力檢測 各組細胞培養(yǎng)24 h后以0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞,加入1 mL培養(yǎng)液重懸后計數(shù)。以5 000 cells/well接種到96孔培養(yǎng)板, 分組培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8 細胞計數(shù)試劑，于37 ℃孵育4 h，酶標儀450 nm下讀取吸光度(A)值。

2.4細胞遷移能力檢測

① Transwell小室 各組細胞培養(yǎng)24 h后以0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞,加入1 mL培養(yǎng)液重懸后計數(shù)。調(diào)整細胞密度，于24孔板中放入Transwell小室(孔徑8 μm)。下室加入600 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，上室加入100 μL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室,PBS淋洗,用棉簽擦去微孔膜上層的細胞, 4%多聚甲醛固定10 min,0.25%結(jié)晶紫染色。隨機計數(shù)5個視野(×400)，評價內(nèi)皮細胞(endothelial cells,ECs)的遷移能力。

② 劃痕實驗 以0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞,重懸后計數(shù)。以相同細胞數(shù)接種到24孔培養(yǎng)板，24 h后更換無血清的培養(yǎng)基同步化48 h，然后隨機分組處理，每組3個復孔。各組細胞培養(yǎng)24 h后，用無菌1 000 μL槍頭(直徑約1 mm)在各孔細胞生長單層的相同位置劃平行直線，造成“傷口”，PBS洗2次，去除劃痕造成的脫落的細胞；加入含5%FBS的培養(yǎng)液2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸除培養(yǎng)液，PBS洗3次，4%甲醛固定20 min；1% Triton X-100作用5 min；PBS洗3次，蘇木精染色5 min，雙蒸水沖洗；顯微鏡下觀察，隨機選取3個視野拍攝(×10),計數(shù)遷移過劃痕邊緣的細胞數(shù),計算均值。

2.5DAPI觀察細胞凋亡形態(tài)學變化 以0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞,重懸后計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×108cells/L，取300 μL細胞懸液接種到置于6孔培養(yǎng)板的2 cm×2 cm的蓋玻片上，置孵箱2 h細胞貼壁后加入1 mL培養(yǎng)液，隨機將玻片分為對照組、10 μg/L雷帕霉素和100 μg/L雷帕霉素組，每組3片，培養(yǎng)24 h后，免疫染色固定液固定15 min，DAPI染色15 min(避光操作)，吸除染液，PBS洗滌2次，用抗熒光淬滅劑封片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察DAPI染色細胞核形態(tài)：出現(xiàn)細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)濃縮狀態(tài)；染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞核呈碎塊狀致密濃染，均認為是凋亡細胞核。

2.6檢測caspase-3活性 細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，換無血清培養(yǎng)基孵育48 h使細胞同步化，各組細胞干預處理后，提取蛋白。以含1%PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，12 000×g4 ℃離心15 min，提取上清，BCA法測定蛋白濃度后，取等量蛋白樣品(40 μg)點樣，10%SDS-PAGE凝膠進行電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，300 mA 1 h，含5%脫脂奶粉TBST 37 ℃封閉1 h，加兔抗人activated caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)為Ⅰ抗，以GAPDH作為內(nèi)參照標化caspase-3蛋白質(zhì)表達。4 ℃過夜，TBST充分洗滌后加HRP標記IgG(1∶1 000)為Ⅱ抗，室溫作用1 h，洗膜后ECL系統(tǒng)顯色，用Quantity One 凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

2.7TRAIL表達的檢測 細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，換無血清培養(yǎng)基孵育48 h使細胞同步化，各組細胞干預處理后，提取蛋白。以含1%PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，12 000×g4 ℃離心15 min，提取上清，BCA法測定蛋白濃度后，取等量蛋白樣品(40 μg)點樣，10%SDS-PAGE凝膠進行電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，300 mA 1 h，含5%脫脂奶粉TBST 37 ℃封閉1 h，加兔抗人TRAIL多克隆抗體(1∶1 000)為 Ⅰ 抗，以GAPDH作為內(nèi)參照標化TRAIL蛋白質(zhì)表達。4 ℃過夜，TBST充分洗滌后加HRP標記IgG(1∶1 000)Ⅱ抗，室溫作用1 h，洗膜后ECL系統(tǒng)顯色，用Quantity One 凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1雷帕霉素對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響

采用CCK-8法檢測各組細胞的增殖能力變化,結(jié)果顯示,與對照組相比，除1 μg/L雷帕霉素作用組外，10 μg/L和100 μg/L雷帕霉素均能抑制內(nèi)皮細胞增殖能力(P<0.01)，且100 μg/L雷帕霉素作用組與1 μg/L雷帕霉素作用組之間差異顯著(P<0.01),見圖1。

Figure 1. Effect of rapamycin on the proliferation ability of ECs.s. n=4.*P<0.05，** P<0.01 vs control group; △P<0.05 vs rapamycin 1 μg/L group.

2雷帕霉素對內(nèi)皮細胞遷移能力的影響

采用Transwell小室和劃痕實驗檢測各組內(nèi)皮細胞遷移能力的變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，雷帕霉素(1-100 μg/L)能抑制內(nèi)皮細胞的遷移能力(P<0.01),見圖2、3。

3雷帕霉素對內(nèi)皮細胞凋亡形態(tài)的影響

使用激光共聚焦顯微鏡觀察雷帕霉素對ECs的凋亡形態(tài)學改變，DAPI染色細胞核改變見圖4。對照組呈正常細胞核染色，為均勻淺藍色；雷帕霉素10 μg/L組和100 μg/L組ECs細胞核出現(xiàn)凋亡形態(tài)改變，核濃縮，見藍色熒光。

4雷帕霉素對內(nèi)皮細胞凋亡的影響

采用Westorn blotting法檢測caspase-3蛋白的活化來顯示細胞凋亡率，結(jié)果顯示：1-100 μg/L雷帕霉素能夠增加內(nèi)皮細胞caspase-3蛋白的表達(P<0.01)，說明雷帕霉素能誘導內(nèi)皮細胞凋亡，見圖5。

5雷帕霉素對內(nèi)皮細胞TRAIL表達的影響

采用Western blotting檢測雷帕霉素是否能誘導內(nèi)皮細胞中TRAIL的表達。結(jié)果顯示,除1 μg/L雷帕霉素作用組外，10 μg/L和100 μg/L雷帕霉素作用24 h后TRAIL表達與對照組比較顯著增加(P<0.01)，且10 μg/L和100 μg/L雷帕霉素作用組與1 μg/L雷帕霉素作用組之間差異顯著(P<0.01)，見圖6。

Figure 2. The migration ability of human umbilical vein endothelial cells detected by Transwell chambers(×400). n=3.**P<0.01 vs control group.

討 論

血管內(nèi)皮由單層內(nèi)皮細胞排列組成，是血管壁與循環(huán)中血液及其它物質(zhì)的屏障，在調(diào)節(jié)血管收縮舒張狀態(tài)、維持凝血及纖溶系統(tǒng)平衡、抑制血小板聚集、抑制炎癥細胞與血管內(nèi)皮細胞間的黏附以及調(diào)控血管平滑肌生長等方面有重要生理功能。受損內(nèi)膜的再內(nèi)皮化可由損傷周邊內(nèi)皮細胞增殖、遷移修復。內(nèi)皮損傷與功能失調(diào)是PCI術(shù)后再狹窄發(fā)生的啟動因素，促進內(nèi)皮恢復已成為預防PCI術(shù)后再狹窄的新策略。

Figure 3. The migration ability of human umbilical vein endothelial cells dected by wound healing test(×100). ±s. n=3.**P<0.01 vs control group.

近年來雷帕霉素洗脫支架廣泛應用于臨床，緩慢洗脫的雷帕霉素通過與FKBP-12 結(jié)合形成RAPA-FKBP-12復合物并與其靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)結(jié)合，抑制mTOR活性，阻止細胞周期進展,能有效抑制平滑肌細胞遷移、增殖和胞外基質(zhì)的合成。但多個研究均顯示[10-14]雷帕霉素在抑制平滑肌細胞遷移、增殖的同時,能促進內(nèi)皮細胞凋亡、抑制其增殖和遷移，能降低一些生長、趨化因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等在血管內(nèi)皮的表達，并可通過阻斷mTOR蛋白來抑制他汀類藥物、VEGF等誘導的內(nèi)皮細胞增殖與遷移，但其具體機制尚不清楚。而如何解決支架表面的藥物涂層對周圍正常的內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮祖細胞的功能抑制，從而達到既能抑制支架再狹窄，又能保證血管的再內(nèi)皮化而防止血栓形成成為新時代藥物支架面臨的重點和難點。

Figure 4. Morphological changes in apoptotic ECs(×400).Apoptotic nuclei are condensed or fragmented and brightly stained with DAPI.

Figure 5. Effect of rapamycin on caspase-3 activation in ECs. ±s. n=3. Rapamycin(1-100 μg/L) activated caspase-3 in a dose-dependent manner.** P<0.01 vs control group.

TRAIL是由Wiley 等[15]于1995年首先發(fā)現(xiàn)并克隆成功的腫瘤壞死因子家族第3個新成員，它與TNF家族的FasL和TNF-α一樣可以引起細胞的凋亡。TRAIL是II型跨膜蛋白，誘騙受體DcR1和DcR2胞內(nèi)沒有死亡機構(gòu)域(death domain, DD)，僅表達于正常細胞中，保護細胞不受到TRAIL的凋亡作用，死亡受體DR4和DR5胞內(nèi)含有由79個氨基酸組成的DD，被激活之后形成異源二聚體，通過胞內(nèi)的DD和fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated death domain,FADD)與caspase-8的死亡效應結(jié)構(gòu)

Figure 6. Effect of rapamycin on expression of TRAIL in ECs.s. n=3.** P<0.01 vs control group;△△P<0.01 vs rapamycin 1 μg/L group.

域(death-effector domain,DED)區(qū)結(jié)合，引起caspase家族的級聯(lián)反應，最終使caspase-3活化而導致細胞凋亡。現(xiàn)認為caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，是caspase家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細胞凋亡過程中的主要效應因子，是多種凋亡刺激信號轉(zhuǎn)導的匯聚點，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志。目前對TRAIL的研究也多集中在腫瘤領(lǐng)域，而在心血管領(lǐng)域的研究較少見。Li等[9]研究證實，臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中表達TRAIL-R1、TRAIL-R2，并發(fā)現(xiàn)TRAIL可致血管內(nèi)皮細胞凋亡。本實驗研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以誘導體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡并抑制其增殖、遷移能力，并應用Western blotting法檢測TRAIL及其在雷帕霉素損傷的血管內(nèi)皮細胞中有大量的表達，表明TRAIL分子在雷帕霉素誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷中有可能發(fā)揮著一定的作用，這可能是雷帕霉素抑制血管內(nèi)支架置入術(shù)后內(nèi)皮修復及導致遲發(fā)性支架內(nèi)血栓形成的機制之一。而是否能以此為靶點進行干預或通過給予TRAIL抑制劑來防治支架后內(nèi)皮功能不全及這樣做是否會帶來其它負面效應，尚需進一步研究探討。

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Tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligandparticipatesininjuryofvascularendothelialcellsinducedbyrapamycininvitro

YE Sheng, ZHANG Huai-qin, LIN Yi-nuo, HUANG Wei-jian, ZHANG Yan-li, SHAO Xiao-lin

(InstituteforCardiovascularBiologyandGene,DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:zhanghuaiqin@126.com)

AIM: To investigate the effects of rapamycin on apoptosis, proliferation, migration ability and tumor related apoptosis inducing ligand(TRAIL) in cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).METHODSCultured HUVECs were treated with rapamycin at the concentrations of 0, 1, 10 and 100 μg/L for 24 h. The cell proliferation was measured by CCK-8 method. The cell migration ability was detected by Transwell chambers and wound healing test. The apoptotic index of HUVECs was quantitatively determined by measuring the activation of caspase-3. The morphological changes of the apoptotic cells were observed by DAPI staining. The expression of TRAIL was detected by Western blotting.RESULTSA 24 h-incubation with rapamycin(1-100 μg/L) caused significant cell loss associated with the increase in apoptosis, as quantified by the determination of caspase-3 activity(P<0.01) in HUVECs. Obvious apoptotic morphology was observed by DAPI staining in HUVECs incubated with rapamycin. Rapamycin at the concentrations of 1-100 μg/L also impaired the migration ability of HUVECs(P<0.01). In addition, rapamycin(10-100 μg/L) inhibited the proliferation of HUVECs, whereas rapamycin at 1 μg/L had no such effect(P<0.01). Rapamycin(10-100 μg/L) also induced TRAIL expression in a dose-dependent manner(P<0.01).CONCLUSIONRapamycin induces apoptosis, and inhibits the proliferation and migration of HUVECs. The up-regulation of TRAIL might be related to the injury of vascular endothelial cells caused by rapamycin.

Rapamycin; Endothelial cells; Apoptosis; Cell proliferation; Cell migration; Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-009

1000-4718(2011)02-0254-06

2010-08-21

2010-11-30

溫州市科技局科技項目基金資助項目(No.H20080024;No.H20100009)

△通訊作者 Tel:0577-88717594；E-mail：zhanghuaiqin@126.com