α-生育酚對慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化的影響

蔣斐 滿曉華 龔燕芳 高軍 廖專 胡良皞 李兆申

·論著·

α-生育酚對慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化的影響

蔣斐 滿曉華 龔燕芳 高軍 廖專 胡良皞 李兆申

目的觀察抗氧化劑α-生育酚對慢性胰腺炎(CP)大鼠胰腺纖維化的作用，探討其機(jī)制。方法雄性Wistar大鼠按完全隨機(jī)法分為對照組、ANP組、α-生育酚組。采用尾靜脈單次注射8 mg/kg體重二丁基二氯化錫(dibutyltindich loride, DBTC)造模。造模24 h后，α-生育酚組大鼠給予800 mg/kg體重的α-生育酚灌胃,每日1次，持續(xù)4周。ANP組和對照組給予0.6 ml色拉油灌胃。4周后處死大鼠，取胰腺組織行病理評分及膠原染色，檢測胰腺組織丙二醛(MDA)和羥脯氨酸水平，實(shí)時定量PCR法檢測胰腺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)。結(jié)果灌胃4周后，α-生育酚組大鼠胰腺組織炎癥、纖維沉積、異常結(jié)構(gòu)等損傷均較ANP組明顯減輕；胰腺組織MDA和羥脯氨酸水平較ANP組顯著降低[(0.40±0.20)nmol/100 mg蛋白比(1.07±0.41)nmol/100mg蛋白；(402.49±27.62)μg/g蛋白比(664.92±29.04)μg/g蛋白，P值均<0.05]；胰腺TGF-β1 mRNA表達(dá)較ANP組顯著降低(2.24±0.89比3.35±0.66，P<0.05)。結(jié)論α-生育酚通過降低CP大鼠的體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，降低TGF-β1 mRNA表達(dá)，從而減輕胰腺組織的炎癥反應(yīng)和纖維化程度。

胰腺炎，慢性； 氧化性應(yīng)激； 纖維化； α-生育酚

慢性胰腺炎(CP)是由于各種因素造成的胰腺組織進(jìn)行性的慢性炎癥性疾病。胰腺出現(xiàn)不同程度的腺泡萎縮，胰管變形、纖維化及鈣化，臨床上通常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛和內(nèi)、外分泌功能不全[1]。由于其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制未明，目前尚無特異和有效的治療手段。本研究采用α-生育酚干預(yù)實(shí)驗(yàn)性CP大鼠，觀察其對胰腺纖維化的影響。

材料與方法

一、動物模型制備及分組

雄性Wistar大鼠24只，體重200 g左右,購自斯萊克公司，清潔環(huán)境飼養(yǎng)。按分層隨機(jī)法將大鼠分為對照組、CP組和α-生育酚組。采用二丁基二氯化錫(DBTC)(Sigma公司，美國)尾靜脈注射誘導(dǎo)CP大鼠模型[2]。DBTC先溶解于100%的無水乙醇中，然后與甘油以2∶3比例混合。CP組及α-生育酚組大鼠經(jīng)尾靜脈注射DBTC溶液200 μl(DBTC 8 mg/kg體重)，對照組注入200 μl 100%無水乙醇和甘油混合溶劑。將α-生育酚(Sigma公司，美國)均勻溶解于色拉油中，其濃度為266 mg/ml。造模后24 h，α-生育酚組每日給予α-生育酚800 mg/kg體重(0.6 ml)灌胃，ANP組和對照組給予0.6 ml色拉油灌胃，持續(xù)4周。

二、胰腺組織病理檢查及膠原染色

4周后處死大鼠，取胰頭組織置于10%甲醛溶液，常規(guī)病理檢查。其余胰腺組織置-80℃保存。由2位病理學(xué)專家參考文獻(xiàn)[3] 對胰腺異常結(jié)構(gòu)、腺泡萎縮、假性復(fù)合物、纖維化、水腫、炎癥程度6個指標(biāo)進(jìn)行評分[3]。此外，應(yīng)用Sirius Red染色試劑盒(杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)對組織切片行Sirius Red染色，膠原著色部分為鮮紅色。

三、胰腺組織丙二醛(MDA)和羥脯氨酸含量檢測

取凍存胰腺組織，制備組織勻漿，應(yīng)用MDA和羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)檢測MDA(nmol/100 mg蛋白)及羥脯氨酸(μg/g蛋白)含量，按說明書操作。

四、胰腺組織TGF-β1 mRNA檢測

采用Trizol(Sigma公司)提取胰腺組織總mRNA,使用One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Kit(Takara)反轉(zhuǎn)成cDNA，實(shí)時定量PCR方法檢測TGF-β1 mRNA。TGF-β1正義引物為5′-CTT-CAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3′，反義引物5′-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3′。β-actin正義引物為5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′，反義引物為5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′。獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算機(jī)分析Ct值。采用2-△△CT法計(jì)算mRNA表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、胰腺組織病理學(xué)變化

造模4周后，ANP組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，腺泡和小葉間炎細(xì)胞浸潤，腺泡空泡樣變和壞死，假性復(fù)合物形成，小葉間和小葉內(nèi)出現(xiàn)大量的纖維組織增生，胰管擴(kuò)張明顯。α-生育酚組在胰腺結(jié)構(gòu)改變、腺泡萎縮、假性復(fù)合物、纖維化和炎癥等方面較CP組減輕。對照組胰腺無明顯病理改變(圖1上)。病理評分結(jié)果詳見表1。

圖1CP組(a)、α-生育酚組(b)、對照組(c)大鼠胰腺病理改變(上，HE ×200)及膠原纖維沉積(下，Sirius Red 染色 ×200)

表1 各組胰腺組織病理評分

注：與CP組比較，aP<0.05

二、膠原纖維沉積

CP組胰腺結(jié)構(gòu)紊亂，小葉間隙有鮮紅色條索狀、網(wǎng)狀的膠原纖維沉積(胰管周圍和血管周圍除外)；α-生育酚組小葉間隙膠原沉積減輕；對照組除胰管和血管周圍外未見紅色膠原纖維沉積(圖1下)。

三、胰腺組織MDA和羥脯氨酸含量變化

對照組、CP組、α-生育酚組大鼠胰腺組織MDA含量分別為(0.11±0.06)、(1.07±0.41)、(0.40±0.20)nmol/100 mg蛋白；羥脯氨酸含量分別(173.24±11.97)、(664.92±29.04)、(402.49±27.62)μg/g蛋白。α-生育酚組均顯著低于ANP組，但仍顯著高于對照組(P值均<0.05)。

四、胰腺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)變化

對照組、CP組、α-生育酚組大鼠胰腺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)量分別為0.82±0.30、3.35±0.66、2.24±0.89，α-生育酚組顯著低于ANP組，但仍顯著高于對照組(P值均<0.05)。

討 論

氧化-應(yīng)激學(xué)說被認(rèn)為是CP的病理生理機(jī)制之一。該學(xué)說認(rèn)為，肝臟解毒酶過度激活產(chǎn)生的自由基氧化物分泌入膽管后反流入胰管，對胰腺實(shí)質(zhì)造成損傷。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，氧化應(yīng)激參與了多種CP動物模型的病理生理過程[4-7]，臨床研究也顯示，CP患者血漿脂質(zhì)過氧化物水平較正常人高[8]。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物，可間接反映組織內(nèi)氧自由基含量，檢測MDA水平可評估體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。

胰腺組織纖維化是CP的主要病理特征，其主要本質(zhì)為慢性炎癥導(dǎo)致TGF-β1等炎癥因子增多，激活胰腺內(nèi)纖維化始動細(xì)胞胰腺星形細(xì)胞(PSC)，PSC分泌大量的膠原纖維，導(dǎo)致過多的細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)沉積。

α-生育酚是維生素E在自然界中存在數(shù)量最多的一種異構(gòu)體，是一種公認(rèn)的較強(qiáng)的抗氧化劑[9]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，800 mg/kg體重α-生育酚連續(xù)灌胃4周，大鼠胰腺M(fèi)DA水平降低、TGF-β1 mRNA表達(dá)減少，胰腺炎癥和纖維化程度明顯改善。因此，α-生育酚可以作為預(yù)防及治療CP的藥物之一。但它不能完全阻斷胰腺的炎癥反應(yīng)，尚需結(jié)合其他協(xié)同的藥物治療CP。

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2011-01-25)

(本文編輯：呂芳萍)

Theeffectofα-tocopherolonfibrosisofchronicpancreatitisrat

JIANGFei,MANXiao-hua,GONGYan-fang,GAOJun,LIAOZhuan,HULiang-Hao,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email：zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the effect of α-tocopherol on fibrosis of chronic pancreatitis (CP) rat and explore its mechanism.MethodsMale Wistar rats were randomly divided into control group, acute necrotizing pancreatitis (ANP) group, α-tocopherol group. CP was induced by dibutyltindich loride (8 mg/kg) infusion into the tail vein. Gastric lavage of α-tocopherol (800 mg/kg body weight, daily) was started 24 hours after dibutyltindich loride infusion for 4 weeks. The rats in ANP and control group

0.6 ml salad oil gastric lavage. The rats were sacrificed 4 weeks later. Pancreatic tissue was harvested for histological examination and collagen staining, and measurement of the levels of hydroxyproline and malondialdehyde (MDA) of the pancreas were performed. The mRNA expression of transforming growth factor (TGF)-β1 was measured by real time PCR.ResultsAfter gastric lavage for 4 weeks, the pancreatic tissue inflammation, fiber deposition and abnormal structure in rats of α-tocopherol group were greatly reduced. The levels of MDA and hydroxyproline in rats of α-tocopherol group were significantly lower than those in ANP group [(0.40±0.20)vs(1.07±0.41) nmol/100mg, (402.49±27.62)vs(664.92±29.04) μg/g,P<0.05]. The expressions of TGF-β1 mRNA in rats of α-tocopherol group were significantly lower than those in ANP group (2.24±0.89vs3.35±0.66,P<0.05).ConclusionsTocopherol gamma can improve pancreatic inflammation and fibrosis by reducing the oxidative stress level and down-regulating the expression of TGF-β1mRNA in rats with CP.

Pancreatitis chronic; Oxidative stress; Fibrsis; α-Tocopherol

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.016

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81100316)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email: zhsli@81890.net