磷脂酰肌醇3-激酶γ對急性胰腺炎小鼠胰腺腺泡細胞自噬作用的影響

賈文焯 孫建華 韋軍民

·論著·

磷脂酰肌醇3-激酶γ對急性胰腺炎小鼠胰腺腺泡細胞自噬作用的影響

賈文焯 孫建華 韋軍民

目的探討磷脂酰肌醇3-激酶γ(PI3Kγ)對小鼠實驗性急性胰腺炎胰腺腺泡細胞自噬作用的影響，并探討其意義。方法野生型C57BL/6小鼠和PI3Kγ 基因敲除小鼠各18只，按數(shù)字表法隨機分為對照組(6只)和急性胰腺炎(AP)組(12只)，采用蛙皮素50 μg/kg體重腹腔內(nèi)注射7次、每次間隔1 h的方法制備AP模型。首次注射后7 h處死小鼠，光鏡下觀察胰腺病理學(xué)變化，免疫熒光檢測自噬泡主要組成蛋白LC3顆粒，熒光分光光度計測定胰蛋白酶活性,蛋白質(zhì)印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3-Ⅱ和p62的表達。結(jié)果AP組野生型小鼠和PI3Kγ 基因敲除小鼠的胰腺自噬空泡數(shù)量分別為 (5.14±0.85)、(2.25±0.54)個/每高倍視野(HPF)，LC3熒光免疫顆粒數(shù)量分別為(78.6±9.38)、(26.4±4.21)個/HPF，胰蛋白酶活性分別為 (0.827±0.126)、(0.358±0.098)pmol/mg蛋白，各組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。野生型小鼠的p62蛋白表達較PI3Kγ基因敲除小鼠顯著減弱(0.11比0.92，P<0.05)，而LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表達較PI3Kγ基因敲除小鼠顯著增強(1.82比0.93,1.43比1.05，P值均<0.05)。結(jié)論AP時PI3Kγ可能通過增強小鼠胰腺腺泡細胞的自噬作用，促進胰蛋白酶原的活化及誘導(dǎo)腺泡細胞壞死。

胰腺炎； 磷脂酰肌醇3-激酶γ； 蛙皮素； 自噬

急性胰腺炎(AP)的早期特征是胰腺腺泡細胞胞質(zhì)出現(xiàn)空泡[1-2]。研究表明，胞質(zhì)空泡來源于細胞的自噬作用。自噬作用也參與胰蛋白酶原的活化過程，且與空泡的數(shù)量及AP的嚴重程度成正比[3-4]。磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途徑是自噬調(diào)控的主要通路之一，而此家族中的PI3Kγ在調(diào)控炎癥細胞功能方面有重要作用。本實驗采用PI3Kγ基因敲除小鼠制備AP模型，觀察PI3Kγ對AP小鼠胰腺腺泡細胞自噬作用的影響，探討其意義。

材料和方法

一、實驗動物及分組

SPF級近交系C57BL/6野生型小鼠和PI3Kγ基因敲除小鼠各18只,雄性，8～12周齡,體重(25±7)g，由美國加州大學(xué)洛杉磯分校動物中心提供。按數(shù)字表法隨機將兩種小鼠分為AP組(12只)和對照組(6只)。采用腹腔內(nèi)注射蛙皮素(美國Sigma公司) 50 μg·kg-1·h-1、共7次的方法制備AP模型；對照組腹腔內(nèi)注射等容積生理鹽水。7次注射后處死小鼠，獲取胰腺組織。大部分置-80℃保存，小塊組織用甲醛固定。

二、方法

1．胰腺病理學(xué)檢查：按常規(guī)操作。取10個高倍視野計算空泡數(shù)，取均值。

2．自噬泡組成蛋白LC 3B檢測：采用免疫熒光染色法。熒光顯微鏡下取10個高倍視野計算熒光顆粒數(shù)，取均值。

3．胰蛋白酶活性測定：冷凍的胰腺組織在液氮中研磨后，置于300～600 μl胰蛋白酶活性測定緩沖液A(5 mmol/L乙磺酸,pH6.5,1 mmol/L MgSO4,250 mmol/L蔗糖)中，取25 μl勻漿加入預(yù)熱的緩沖液B(50 mmol/L Tris,pH8.0,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L CaCl2)開始測定，30 s后暫停測定，加入3 μl 20 mmol/L的胰蛋白酶熒光底物Boc-Gln-Ala-Arg-AMCoHCl(Biomol International公司)，再測定300 s，記錄至少5個時點的熒光值。λex為380 nm，λem為440 nm。通過熒光增量曲線斜率計算每毫克蛋白質(zhì)中活性胰蛋白酶含量[3]。

4．自噬相關(guān)蛋白p62、LC3B、beclin1表達的檢測：采用蛋白質(zhì)印跡法。使用RIPA裂解液將胰腺組織制成勻漿?？筽62、beclin1(H300)一抗購自Santa Cruz公司，抗LC3B抗體購自Cell Signaling公司。ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo scientific公司。最后用FluorChem?HD2凝膠成像系統(tǒng)成像及Alpha View圖像定量分析軟件分析電泳條帶灰度值，以AP組與對照組的比值表示蛋白表達的倍數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、胰腺病理改變

對照組的野生型和PI3Kγ基因敲除小鼠的胰腺組織大體及鏡下均無明顯變化，空泡數(shù)量分別為(0.39±0.09)、(0.38±0.12)個/每高倍視野(HPF)，LC3熒光顆粒數(shù)分別為(5.45±1.25)、(4.66±1.28)個/HPF。AP組野生型小鼠的胰腺腫脹,色暗紅,表面見多處皂化斑及出血點,胰腺與周圍組織分界不清，大網(wǎng)膜、腸系膜可見多發(fā)出血點；鏡下見胰腺高度水腫,細胞結(jié)構(gòu)模糊不清,胞質(zhì)內(nèi)空泡形成,局部有融合性壞死灶，壞死區(qū)內(nèi)大量中性粒細胞和單核細胞浸潤，空泡數(shù)量為(5.14±0.85)個/HPF，LC3熒光顆粒數(shù)為(78.6±9.38)個/HPF。AP組PI3Kγ基因敲除小鼠的胰腺腫脹,色暗紅,表面未見皂化斑及出血點,胰腺與周圍組織分界尚可，大網(wǎng)膜、腸系膜可見少量出血點；鏡下見胰腺輕度充血、水腫,少量中性粒細胞和單核細胞浸潤,少數(shù)局灶性腺泡壞死，空泡數(shù)量為(2.25±0.54)個/HPF，LC3熒光顆粒數(shù)為(26.4±4.21)個/HPF。AP組的空泡數(shù)量、LC3顆粒數(shù)均顯著高于對照組(P值均<0.05)；AP組PI3Kγ基因敲除小鼠較野生型小鼠均明顯減少(P值均<0.05)。

二、胰腺組織胰蛋白酶活性變化

對照組的野生型和PI3Kγ基因敲除小鼠的胰蛋白酶活性分別為(0.186±0.058)、(0.146±0.035)pmol/mg蛋白，兩者無顯著差異。AP組的野生型和PI3Kγ基因敲除小鼠胰蛋白酶活性分別為(0.827±0.126)、(0.358±0.098)pmol/mg蛋白，PI3Kγ基因敲除小鼠較野生型小鼠明顯降低(P<0.05)。

三、p62、LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表達的變化

AP組與對照組野生型小鼠胰腺p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表達量比值分別為0.11、3.23、1.82、1.43； PI3Kγ基因敲除小鼠的比值分別為0.92、4.20、0.93、1.05(圖1)。野生型小鼠胰腺p62蛋白表達較PI3Kγ基因敲除小鼠明顯減弱(P<0.05)，而LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表達較PI3Kγ基因敲除小鼠顯著增加(P值均<0.05)，LC3-Ⅰ蛋白表達則無顯著差異。

圖1兩AP組小鼠胰腺組織中p62、LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表達

討 論

自體吞噬在進化過程中高度保守，參與清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細胞器、代謝產(chǎn)物，降解絕大多數(shù)的長半衰期蛋白質(zhì)[1]。自噬的形態(tài)學(xué)改變是自噬泡的形成。自噬作用可將胰蛋白酶原轉(zhuǎn)運到酸性環(huán)境中，然后進入溶酶體，導(dǎo)致胰蛋白酶原的激活。LC3蛋白是自噬泡主要的組成蛋白，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成，現(xiàn)已作為自噬體的特異性標記蛋白。其中LC3-Ⅱ表達量的變化在一定程度上反映了細胞的自噬活性的變化[5]。

自體吞噬的調(diào)控機制非常復(fù)雜，磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途徑是自噬調(diào)控的主要通路之一。PI3Kγ參與調(diào)控細胞的自噬過程。Lupia等[6]應(yīng)用PI3Kγ基因敲除小鼠制備AP模型，結(jié)果可明顯減輕腺泡細胞的損傷與壞死。本實驗使用PI3Kγ基因敲除小鼠，其胰腺腺泡細胞內(nèi)空泡數(shù)量及LC3-Ⅱ顆粒數(shù)量、胰蛋白酶活性與野生型小鼠無明顯差異，但應(yīng)用蛙皮素制備AP模型后，其胰腺腺泡細胞內(nèi)空泡數(shù)量及LC3-Ⅱ顆粒數(shù)量均較野生型小鼠明顯減少、胰蛋白酶活性也較野生型小鼠明顯降低，證實PI3Kγ參與AP發(fā)展過程中的自體吞噬作用。

p62是一種泛素結(jié)合蛋白及LC3結(jié)合蛋白，主要通過自噬代謝。在自噬功能正常或過剩時，p62會被及時代謝，如果p62發(fā)生集聚，說明自噬過程受到抑制[7]。本實驗結(jié)果顯示，PI3Kγ基因敲除小鼠的p62蛋白表達水平高于野生型小鼠，提示PI3Kγ基因敲除可減弱自體吞噬過程。

Beclin1是哺乳動物最早發(fā)現(xiàn)的一個自噬基因,主要通過與Ⅲ型PIK形成復(fù)合體來調(diào)控其他自噬蛋白定位到自噬前體的結(jié)構(gòu)中，從而調(diào)節(jié)自噬活性[8],其表達強度與自噬活性密切相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，PI3Kγ基因敲除小鼠誘發(fā)AP后胰腺組織中beclin1蛋白的表達明顯低于野生型小鼠，也提示PI3Kγ基因敲除可減弱自體吞噬過程。

總之，PI3K 可能在自體吞噬早期階段通過促進LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化和beclin1的表達增強自噬作用，促進胰蛋白酶原的活化，從而加速細胞壞死過程。

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2011-02-15)

(本文編輯：呂芳萍)

InfluenceofPI3Kgammaonpancreaticacinarcellsautophagyinexperimentalacutepancreatitisinmice

JIAWen-zhuo,SUNJian-hua,WEIJun-min.

DepartmentofGeneralSurgery,BeijingHospital,Beijing100730,China

JIAWen-zhuo,Email：jiawenzhuo@sina.com

ObjectiveTo investigate the influence of phosphoinositide 3-Kinase-C2-gamma (PI3Kγ) on pancreas acinar cells autophagy in experimental acute pancreatitis in mice and explore its significance.MethodsEighteen C57BL/6 wild type (WT) and eighteen PI3Kγ knockout (KO) mice were randomly divided into control group (n=6) and acute pancreatitis (AP) group (n=12) ,respectively. AP models were induced by intraperitoneal injection of 50 μg cerulein /kg body weight, once the other hour for seven times. The mice were sacrificed 7 hours after model induction．The pathological changes of the pancreas were observed through microscope, LC3 dots were determined by immunofluorescence, the trypsin activity was measured by fluorescence spectrophotometer, and the expression of autophagy related protein beclin1, p62 and LC3-Ⅱ were measured by Western blot.ResultsThe autophagy vacuoles counts in pancreatic tissue of WT mice and KO mice were (5.14±0.85), (2.25±0.54)/HPF, the LC3 immunofluorescence dots counts were (78.6±9.38), (26.4±4.21)/HPF, the trypsin activities were (0.827±0.126), (0.358±0.098)pmol/mg protein, the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The p62 protein expression was greatly decreased in WT mice compared with their KO counterpart (0.11vs0.92,P<0.05), while the expressions of LC3Ⅱ, beclin1 were greatly increased in WT mice compared with their KO counterpart (1.82vs0.93, 1.43vs1.05,P<0.05).ConclusionsPI3Kγ may up-regulate autophagy of pancreatic acinar cells during acute pancreatitis in mice, then promote trypsinogen activation and necrosis of acinar cells.

Pancreatitis; Phosphoinositide 3-Kinase-C2-gamma; Cerulein; Autophagy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.012

100730 北京，衛(wèi)生部北京醫(yī)院普通外科

賈文焯，Email: jiawenzhuo@sina.com