沙利度胺對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響

沈陽(yáng) 許春芳

·論著·

沙利度胺對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響

沈陽(yáng) 許春芳

目的觀察沙利度胺(THD)體外抑制人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用。方法應(yīng)用不同濃度的THD(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/ml)處理胰腺癌SW1990細(xì)胞24、48、72 h，用MTT法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，AnnexinⅤ/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果THD呈濃度和時(shí)間依賴性抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990的生長(zhǎng)。200 μg/ml的THD干預(yù)使SW1990細(xì)胞G0/G1期比例從(41.15±2.23)%上升到(58.83±2.33)%；細(xì)胞凋亡率從2.6%增加到28.0%；細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量從0.17±0.03上調(diào)到0.33±0.04，Bcl-2蛋白表達(dá)量從0.35±0.02下調(diào)到0.17±0.01，Bcl-2/Bax比值從2.17±0.44下降到0.52±0.07。結(jié)論THD可以抑制SW1990細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期有關(guān)。

胰腺腫瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； 沙利度胺

大約80%的胰腺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部浸潤(rùn)，手術(shù)切除率低，預(yù)后極差,進(jìn)展期胰腺癌的中位生存期僅約6個(gè)月。因此，尋求新的安全有效的化療藥物成為許多學(xué)者研究的焦點(diǎn)之一。沙利度胺(又名反應(yīng)停, thalidomide，THD)是谷氨酸的衍生物，目前發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗腫瘤作用。本研究應(yīng)用沙利度胺體外干預(yù)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。

材料和方法

一、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液研究所惠贈(zèng)，常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×104/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl ，培養(yǎng)至80%融合后，分別加入3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/ml的THD(常州制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)09102213)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，每組5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl輕輕晃勻，37℃培養(yǎng)4 h，去除上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩混勻10 min，在BIOLISA酶標(biāo)儀上測(cè)定492 nm處的吸光度(A492)值。細(xì)胞增殖抑制率=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

二、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用50、100、200 μg/ml的THD處理SW1990細(xì)胞48 h，用含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌，離心，70%乙醇4℃固定過(guò)夜。PBS洗滌后加RNaseA 37℃水浴30 min，最后加入PI 400 μl。于BIOLISA流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞周期；另用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入Binding Buffer 500 μl，加入AnnexinV(FITC)5 μl，混勻后加入5 μl PI，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

以50、100、200 μg/ml的THD處理SW1990細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰上孵育30 min，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法。設(shè)空白對(duì)照組。Bcl-2、Bax一抗及二抗均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，1∶1000稀釋，最后ECL發(fā)光，暗盒曝光、顯影和定影，用明基5000掃描儀掃描。以β-actin作為內(nèi)參。目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示蛋白表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、SW1990細(xì)胞增殖的變化

THD基本呈濃度和時(shí)間依賴性抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990的生長(zhǎng)(圖1)。6.25、12.5 μg/ml組72 h點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率較24 h點(diǎn)顯著增加，≥25 μg/ml各組48、72 h點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均較24 h點(diǎn)顯著增加(P值均﹤0.05)。

與24 h組比較，aP﹤0.05

二、SW1990細(xì)胞周期的變化

50、100、200 μg/ml的THD處理SW1990細(xì)胞48 h后，G0/G1期比例增多，S期和G2/M期比例減少(表1)。

組別G0/G1期G2/M期S期對(duì)照組41．15±2．2334．05±0．8324．80±1．63THD50μg/ml組46．55±2．44a33．00±3．3120．45±0．87a 100μg/ml組53．30±3．17a27．67±3．12a19．02±1．73a 200μg/ml組58．83±2．33a26．30±3．30a14．87±3．28a

注： 與對(duì)照組比較，aP<0.05

三、SW1990細(xì)胞凋亡率的變化

50、100、200 μg/ml的THD處理SW1990細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為8.7%、17.1%、28.0%，均較對(duì)照組顯著增加(P值均<0.05，圖2)。

四、SW1990細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的變化

THD處理SW1990細(xì)胞48 h后，細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)減弱，Bax的表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2/Bax比值下降，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05；圖3，表2)。

圖2 各組SW1990細(xì)胞的凋亡率

圖3 各組SW1990細(xì)胞的Bcl-2、Bax表達(dá)

組別Bcl?2BaxBcl?2/Bax對(duì)照組0．35±0．020．17±0．032．17±0．44THD50μg/ml組0．28±0．03a0．21±0．03a1．33±0．27a 100μg/ml組0．21±0．02a0．27±0．02a0．77±0．13a 200μg/ml組0．17±0．01a0．33±0．04a0．52±0．07a

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

討 論

THD對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤，如前列腺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤等均具有良好的抗腫瘤作用[1]。其機(jī)制廣泛而復(fù)雜，不僅具有抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)功能[2]，而且具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和阻滯細(xì)胞周期作用[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，THD呈濃度和時(shí)間依賴性抑制SW1990的生長(zhǎng)，其中以THD 400 μg/ml作用72 h的增殖抑制作用最為明顯，與Sun等[4]用THD處理肝細(xì)胞癌的研究結(jié)果相似。

細(xì)胞周期調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。申鳳乾等[5]報(bào)道，THD能將人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。本結(jié)果顯示，THD處理SW1990細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例上升，而S、G2/M期細(xì)胞比例減少。但Gao等[6]報(bào)道，THD對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251-MG的細(xì)胞周期無(wú)明顯阻滯作用，可見(jiàn)THD對(duì)細(xì)胞周期的影響可能因腫瘤類型或細(xì)胞類型存在差異。

Bcl-2家族分為促凋亡(Bax、Bak、Bad)和抗凋亡(Bcl-2、Bcl-xL)兩類基因。目前研究發(fā)現(xiàn)，Bc1-2/Bax比例平衡是細(xì)胞凋亡發(fā)生與否的關(guān)鍵因素[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，THD處理SW1990細(xì)胞后，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低，與Dmoszynska等[8]研究結(jié)果相似。進(jìn)一步證實(shí)THD誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞凋亡可能與下調(diào)Bc1-2、上調(diào)Bax基因表達(dá)有關(guān)。

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2011-01-04)

(本文編輯：屠振興)

EffectsofthalidomideonproliferationandapoptosisinhumanpancreaticcancercelllineSW1990

SHENYang,XUChun-fang.

DepartmentofGastroenterology,JianhuHospital,NantongUniversity,Nantong224700,China

XUChun-fang,Email:xcf601@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of thalidomide on the proliferation and apoptosis in human pancreatic cancer cell SW1990 in vitro.MethodsSW1990 cell line was treated with thalidomide at different concentrations (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400 μg/ml) for 24, 48, 72 h, and then cell proliferation were evaluated by MTT. Cell cycle was determined by flow cytometry, apoptosis was determined by annexin V/PI fluos staining, Bcl-2, Bax protein expression and Bcl-2/Bax ratios were measured by Western Blot in vitro.ResultsThalidomide inhibited the proliferation of SW1990 cells in a time and dose-dependant manner. The proportion of G0/G1phase of SW1990 cells with 200 μg/ml thalidomide treatment increased from (41.15±2.23)% to (58.83±2.33)%, apoptosis rate increased from 2.6% to 28.0%, the expression of Bax protein up-regulated from 0.17±0.03 to 0.33±0.04, the expression of Bcl-2 protein down-regulated from 0.35±0.02 to 0.17±0.01, the ration of Bcl-2/Bax decreased from 2.17±0.44 to 0.52±0.07.ConclusionsThalidomide can inhibit the proliferation of pancreatic cancer SW1990 cells by up-regulating Bax, down-regulating Bcl-2, inducing cell apoptosis and cell G0/G1phase arrest.

Pancreatic neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis; Thalidomide

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.008

224700 南通，南通大學(xué)附屬建湖醫(yī)院消化科(沈陽(yáng))；蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科(許春芳)

許春芳，Email:xcf601@163.com