KAI1對人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞自噬的影響

吳春燕 郭曉鐘 王華

·論著·

KAI1對人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞自噬的影響

吳春燕 郭曉鐘 王華

目的觀察感染Ad5-KAI1前后人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2自噬水平的變化，并初步探討其機制。方法應(yīng)用無KAI1表達(dá)的人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa2，通過感染帶有KAI1目的基因的復(fù)制缺陷型腺病毒Ad5-KAI1使細(xì)胞表達(dá)KAI1，以Ad5-null感染作為陰性對照，親本細(xì)胞為空白對照。用透射電鏡觀察細(xì)胞自噬小體，共聚焦顯微鏡觀察自噬標(biāo)志LC3顆粒。應(yīng)用阻斷劑PD98059和LY294002干預(yù)細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白beclin 1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及ERK-1/2、磷酸化ERK-1/2(p- ERK-1/2)、AKT、p-AKT的表達(dá)。結(jié)果以100 MOI Ad5-KAI1感染細(xì)胞24 h，表達(dá)KAI1蛋白的細(xì)胞達(dá)(84.97±8.56)%；LC3顆粒從4個左右增加到20個以上；細(xì)胞線粒體腫脹、變性，胞質(zhì)內(nèi)雙層膜樣結(jié)構(gòu)增加;Beclin1表達(dá)增加(1.4±0.3)倍，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)增加(8.00±2.78)倍。PI3K阻斷劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞后可以有效地抑制MiaPaCa-2細(xì)胞AKT的磷酸化(2.756降至1.516)，但不能抑制LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的增加(0.770增加到1.403)。ERK阻斷劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞后不僅可以有效地抑制MiaPaCa-2細(xì)胞ERK的磷酸化(1.637降至0.403)，而且可以抑制beclin 1蛋白表達(dá)的上調(diào)(2.377降至1.150)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的增加(2.225降至0.680)。結(jié)論KAI1明顯促進(jìn) MiaPaCa2細(xì)胞內(nèi)自噬，它是通過ERK而不是AKT磷酸化途徑促進(jìn)自噬的。

胰腺腫瘤； 基因，腫瘤抑制； 自噬； KAI1

體外實驗顯示，KAI1通過抑制胰腺癌細(xì)胞的運動、遷移來抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，同時抑制癌細(xì)胞的增殖[1-2]。但體內(nèi)實驗提示KAI1對荷瘤裸鼠的原位瘤形成無影響[3]。近來體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)KAI1是缺氧的目的基因。缺氧不僅誘導(dǎo)自噬，而且誘導(dǎo)KAI1的表達(dá)[4]；缺氧和自噬的增加可以提高胰腺癌的惡性程度[5-6]。因此，本研究觀察KAI1對人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2自噬的影響，探討其作用機制。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及腺病毒感染

人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2由本實驗室保存。應(yīng)用含10%胎牛血清的高糖DMEM常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，分別加入終濃度為10 μmol/ml 的阻斷劑PD98059和LY294002(Sigma公司)繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

帶有人KAI1目的基因的重組腺病毒載體Ad5-KAI1和對照腺病毒Ad5-null由本實驗室前期構(gòu)建[7]。Ad5-KAI1和Ad5-null滴度分別為8×109和1×1011pfu/ml，以25、50、100、200 MOI的Ad5-KAI1感染應(yīng)用各阻斷劑及未應(yīng)用阻斷劑的MiaPaCa-2細(xì)胞24 h，以未感染病毒的細(xì)胞作為對照。以100 MOI的Ad5-KAI1感染細(xì)胞0、6、12、24、48 h。

二、KAI1蛋白表達(dá)分析

收集上述各組各時間點MiaPaCa-2細(xì)胞，PBS洗滌及重懸細(xì)胞，加入抗人-CD82FITC抗體避光室溫孵育30 min，PBS洗后上流式細(xì)胞儀分析。

三、細(xì)胞自噬水平檢測

取1×106/ml細(xì)胞懸液200 μl和1 μl質(zhì)粒EGFP-LC3(3 μg/μl，Yoshimori惠贈)，用NeonTM電轉(zhuǎn)儀(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染，G418篩選，獲得表達(dá)EGFP-LC3 的細(xì)胞，應(yīng)用100 MOI的Ad5-KAI1和Ad5-null感染細(xì)胞24 h，4%多聚甲醛固定，DAPI(KeyGEN公司)染色，共聚焦顯微鏡計數(shù)每個細(xì)胞內(nèi)GFP標(biāo)記的LC3顆粒數(shù)。

四、細(xì)胞自噬泡小體的超微結(jié)構(gòu)觀察

從培養(yǎng)皿內(nèi)直接刮下細(xì)胞并收集，PBS洗2遍后懸浮于含2%多聚甲醛、2%戊二醛和0.2 mol/L二甲基胂酸鈉的緩沖液(pH 7.4)中。用含1%(v/v)鋨酸的二甲基胂酸鈉固定，1%乙酸雙氧鈾染色，脫水后用Durcopan(Sigma公司)包埋，超薄切片，在透射電鏡(HITACHI H-7650)下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

五、自噬相關(guān)蛋白beclin 1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及ERK-1/2、磷酸化ERK-1/2(p-ERK-1/2)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)的檢測

常規(guī)提取各組細(xì)胞蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測beclin 1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達(dá)。抗LC3、抗beclin1、抗p-ERK1/2、抗ERK-1/2、抗β-actin、抗p-AKT和抗AKT 抗體均1∶1000稀釋。最后用ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，掃描，以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比表示目的蛋白的表達(dá)量，以對照組的蛋白表達(dá)量為1，計算感染組蛋白表達(dá)量的倍數(shù)。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、KAI1蛋白的表達(dá)

0、25、50、100、200 MOI的Ad5-KAI感染細(xì)胞24 h后，表達(dá)KAI1的細(xì)胞分別為(0.55±0.05)%、(63.75±6.46)%、(71.52±6.11)%、(81.84±5.69)%、(83.33±4.38)%；100 MOI Ad5-KAI感染細(xì)胞0、6、12、24、48 h，表達(dá)KAI1的細(xì)胞分別為0.20%、(15.57±5.68)%、(47.59±10.92)%、(84.97±8.56)%、(81.88±2.02)%。KAI1蛋白的表達(dá)均隨感染病毒的滴度增高和感染時間的延長而增加，但以100 MOI Ad5-KAI1感染24 h為最高。

二、細(xì)胞自噬顆粒數(shù)的變化

對照組、Ad5-null組、Ad5-KAI1組細(xì)胞的自噬顆粒平均數(shù)在6 h時分別為3.4±1.5、2.8±1.1、17.0±1.7；12 h時為4.7±1.6、4.6±1.8、21.3±2.5；24 h時為4.2±2.1、4.4±1.5、21.6±5.8。Ad5-KAI1組細(xì)胞的自噬顆粒隨感染時間的延長而增加，且較Ad5-null組和對照組顯著增加(P值均<0.01，圖1)。對照組與Ad5-null組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 各組細(xì)胞內(nèi)的GFP-LC3顆粒

三、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

Ad5-KAI1組細(xì)胞在感染24 h后細(xì)胞線粒體腫脹、變性，胞質(zhì)內(nèi)雙層膜樣結(jié)構(gòu)增加。而Ad5-null組細(xì)胞未見明顯變化(圖2)。

圖2Ad5-null組(a)和Ad5-KAI1組(b)MiaPaCa-2細(xì)胞的自噬小體(×4000)

四、Beclin 1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)的變化

Ad5-null組、Ad5-KAI1組細(xì)胞在感染6 h時beclin 1表達(dá)量為對照組的(1.2±0.1)、(1.8±0.1)倍，12 h時為(1.4±0.4)、(2.7±0.3)倍，24 h時為(1.1±0.1)、(1.4±0.3)倍；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)在6 h時為對照組的(0.94±0.06)、(1.63±0.21)倍，12 h時為(1.14±0.06)、(4.03±1.56)倍，24 h時為(1.24±0.21)、(8.00±2.78)倍。Ad5-KAI1組較Ad5-null組均顯著增加(P值均<0.05)。

五、ERK-1/2、p-ERK-1/2、AKT、p-AKT表達(dá)的變化

Ad5-KAI1組細(xì)胞AKT和ERK的磷酸化水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值由對照組的0.256、0.787、0.545提高到2.756、1.637和2.225。PI3K阻斷劑LY294002預(yù)處理后，細(xì)胞AKT的磷酸化水平降至1.516，但LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值卻增加到1.403。ERK阻斷劑PD98059預(yù)處理后，細(xì)胞ERK的磷酸化水平從1.637降至0.403，beclin1蛋白表達(dá)從2.377降到1.150，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值從2.225降到0.680(P值均<0.01，圖3)。

討 論

自噬是實體瘤抵抗缺氧、缺血微環(huán)境，適應(yīng)惡劣環(huán)境生存的機制之一[5]。自噬既具有抗腫瘤也具有促腫瘤作用[6-7]。一方面，抑制腫瘤細(xì)胞中的自噬有利于腫瘤的治療；另一方面促進(jìn)自噬通過減少基因突變有利于腫瘤的預(yù)防[8]，所以自噬調(diào)節(jié)是一種有前景的治療和預(yù)防腫瘤的新途徑。

圖3應(yīng)用阻斷劑前后ERK和AKT磷酸化及LC3和beclin1的表達(dá)

KAI1是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，目前尚未見有關(guān)KAI1與自噬關(guān)系的研究。本研究將攜帶KAI1基因的重組腺病毒Ad5-KAI1感染高轉(zhuǎn)移性、無KAI1表達(dá)、且自噬水平低下的人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2。結(jié)果顯示，AD5-KAI1感染的細(xì)胞表達(dá)KAI1、beclin1蛋白，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加，LC3顆粒增多，細(xì)胞內(nèi)形成更多的自噬小泡，證實KAI1能促進(jìn)MiaPaCa-2細(xì)胞的自噬，其機制主要是通過增加beclin 1蛋白表達(dá)和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化來促進(jìn)自噬的。

自噬與細(xì)胞增殖、凋亡共用許多信號通路，PI3K/AKT/PKB途徑在自噬的調(diào)節(jié)中起重要的作用。許多抑癌基因如PTEN、TSC1/2和p53均是通過PI3K mTOR信號途徑促進(jìn)自噬的，許多癌基因也是通過PI3K途徑抑制自噬的[9]。本結(jié)果顯示，感染Ad5-KAI1的細(xì)胞促進(jìn)AKT/PKB和ERK的磷酸化。AKT阻斷劑LY294002干預(yù)后能有效阻斷KAI1引起的AKT磷酸化，但未能阻斷KAI1誘導(dǎo)的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化；而ERK阻斷劑PD98059不僅可以有效阻斷KAI1引起的ERK磷酸化，同時也阻斷KAI1引起的beclin 1表達(dá)上調(diào)和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，表明KIA1不是通過PI3K/AKT/PKB途徑促進(jìn)自噬的，而可能是通過Ras/Raf/MEK/ERK信號通路促進(jìn)自噬的。

[1] 郭曉鐘，徐建華，劉民培，等. KAI1基因抑制胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機制的探討.中華內(nèi)科雜志，2004，43：360-362.

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2011-01-26)

(本文編輯：呂芳萍)

EffectofKAI1onautophagyofhumanpancreaticcancercelllineMiaPaCa-2

WUChun-yan,GUOXiao-zhong,WANGHua.

DepartmentofGastroenterology,ShenyangGeneralHospitalofPLA,Shenyang110016,China

GUOXiao-zhong，Email：Guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo study the change of autophagy of human pancreatic cancer cell MiaPaCa-2 before and after Ad5-KAI1 tranfection, and to investigate the possible mechanism.MethodsThe MiaPaCa-2 cells without KAI1 expression were infected with Ad5-KAI1 with KAI1 target gene, and Ad5-null was used as negative control, and parental cell was used as blank control. The formation of autophagosomes was observed by electromicroscopy. The green fluorescent protein-labeled light chain 3 (LC3) associations with autophagosome membranes was detected by confocal microscopy. PD98059, LY294002 were applied to pre-treat the cells. The expression levels of beclin 1, AKT, ERK, the phosphorylation of AKT and ERK protein and the ratio of LC3-Ⅱ to LC3-Ⅰ were detected by Western blotting.ResultsAfter 100 MOI Ad5-KAI1 infections for 24 h, the rate of cell expressing KAI1 protein reached (84.97±8.56)%, number of LC3 increased from 4 to 20; and swelling, degeneration of mitochondria was observed, and bilayer-like structure in cytoplasm was found. The expression of beclin1 increased (1.4±0.3) folds, and the expression of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰincreased (8.00±2.78)folds. PI3K blockade LY294002 pretreatment significantly suppressed the phosphorylation of AKT of MiaPaCa-2 (2.756vs1.516), but it did not inhibit the increase of ratio of LC3-Ⅱ to LC3-Ⅰ (0.770vs1.403). ERK blockade PD98059 pretreatment not only significantly suppressed the phosphorylation of ERK of MiaPaCa-2 (1.637vs0.403), but also inhibit the up-regulation of beclin 1 protein expression (2.377vs1.150) and increase of ratio of LC3-Ⅱ to LC3-Ⅰ(2.225vs0.680).ConclusionsKAI1 can significantly induce autophagy of human pancreatic cell line MiaPaCa-2 through phosphorylation of ERK rather than AKT.

Pancreatic neoplasms; Genes, tumor suppressor; Autophagy； KAI1

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.006

國家自然科學(xué)基金(81071982、30470798)

110015 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科(吳春燕、郭曉鐘)；北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所(王華)

郭曉鐘，Email:Guoxiaozhong1962@163.com