胰十二指腸同源框因子-1聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞分化為胰島β樣細胞的研究

王博 吳漢青 吳河水 王春友

·論著·

胰十二指腸同源框因子-1聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞分化為胰島β樣細胞的研究

王博 吳漢青 吳河水 王春友

目的探討人臍帶間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)體外誘導(dǎo)分化為胰島β樣細胞的方法。方法用含胰十二指腸同源框因子-1基因(pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX1)重組腺病毒(Adxsi-CMV-PDX1)感染人臍帶MSCs，再聯(lián)合多種細胞因子進行誘導(dǎo)分化。應(yīng)用RT-PCR、免疫熒光染色法檢測誘導(dǎo)后細胞的PDX1、胰島素(insulin)、神經(jīng)元素3(ngn3)、葡萄糖轉(zhuǎn)運體2(glut2)、NK轉(zhuǎn)錄因子6.1(NKX6.1)mRNA的表達；化學(xué)發(fā)光法檢測誘導(dǎo)后細胞培養(yǎng)上清中胰島素和C肽的分泌量；流式細胞儀檢測胰島素陽性細胞率。結(jié)果Adxsi-CMV-PDX1感染臍帶MSCs并聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)后，細胞從短梭形變成長梭形，并聚集形成胰島樣細胞團，經(jīng)雙硫腙染成亮紅色。誘導(dǎo)17 d后的細胞表達PDX1、ngn3、NKX6.1、insulin、glut-2的mRNA；細胞胞質(zhì)內(nèi)有胰島素和C肽；細胞培養(yǎng)上清中胰島素和C肽含量分別為(473.1±51.5)mU/L和(1.61±0.41)ng/ml，用25 mmol/L高糖刺激1 h后，胰島素和C肽分泌量高達(964.4±68.1)mU/L和(3.72±1.52) ng/ml；胰島素陽性細胞率達(11.6±4.8)%。結(jié)論PDX1轉(zhuǎn)入臍帶MSCs后，聯(lián)合細胞因子在體外能夠誘導(dǎo)其分化為胰島β樣細胞，胰島素和C肽分泌水平較高，且對高糖刺激有反應(yīng)，但還不是完全成熟的β細胞。

臍帶； 間質(zhì)干細胞； 胰腺十二指腸同源框因子-1； 胰島β樣細胞； 細胞分化

胰島移植為糖尿病治療帶來了曙光，但是由于供體有限、移植后易引起免疫排斥反應(yīng)、移植細胞的數(shù)量難以控制等問題限制了其臨床應(yīng)用。最近的研究報道，胚胎干細胞和成體干細胞都可以分化為胰島素分泌細胞[1-2]，但誘導(dǎo)效率和胰島素分泌水平低下，不能滿足臨床治療需要。胰十二指腸同源框因子-1(pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX1)是胰腺發(fā)生和胰島發(fā)育的一個重要調(diào)節(jié)基因，在胚胎發(fā)育過程中促進胰腺的早期發(fā)育和晚期β細胞分化，成體中維持β細胞的形態(tài)和功能[3]。Kajiyama等[4]和Hisanaga等[5]分別以PDX1、細胞因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化為胰島素分泌細胞，但胰島素分泌水平均低下。因此，本研究聯(lián)合應(yīng)用PDX1及細胞因子誘導(dǎo)MSCs，觀察其誘導(dǎo)效率及胰島素分泌量。

材料與方法

一、人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

無菌取健康胎兒4～5 cm臍帶， PBS洗滌后剪成約1 mm3組織塊，膠原酶Ⅳ消化、過網(wǎng)后收集細胞濾液，離心、洗滌后置含10%FBS的DMEM/F12常規(guī)培養(yǎng)6～7 d，棄未貼壁細胞，3～4 d 換液1次。待細胞達80%融合后，按1∶3的比例傳代。取第4代細胞，以(1～2)×106/ml的細胞懸液分裝6管，每管0.1 ml，分別加入鼠抗人抗體CD45-PE、CD34-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC、鼠IgG-FITC+IgG-PE，室溫孵育30 min后流式細胞儀檢測。

二、臍帶MSCs的誘導(dǎo)

第4代MSCs培養(yǎng)達70%～80%融合時分為4組：含熒光蛋白GFP的重組腺病毒Adxsi-CMV-PDX1(本所保存)+細胞因子組(聯(lián)合組)、Adxsi-CMV-PDX1組、空病毒+細胞因子組和對照組。病毒感染MSCs 7 d后，先聯(lián)合應(yīng)用100 ng/ml人表皮生長因子(EGF)+2% B27誘導(dǎo)3 d，再聯(lián)合應(yīng)用10 ng/ml胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、10 ng/ml人β細胞調(diào)節(jié)素(β-cellulin)、10 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)、10 mmol/L煙酰胺(NIC)、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、2% B27，在含5% FBS的DMEM/F12中誘導(dǎo)7 d。對照組僅常規(guī)培養(yǎng)。用雙硫腙行細胞染色。

三、MSCs感染后PDX1表達的檢測

取Adxsi-CMV-PDX1感染7 d的MSCs，行細胞爬片，取片行常規(guī)免疫熒光法檢測PDX1的表達。

四、誘導(dǎo)后細胞胰島素和C肽表達的檢測

取各組誘導(dǎo)后細胞行爬片培養(yǎng)，常規(guī)免疫熒光法檢測細胞胰島素及C肽的表達。兔抗人胰島素多抗購自美國Abcam公司。

五、胰島素相關(guān)基因NKX6.1、insulin、glut2、ngn3 mRNA及PDX1 mRNA檢測

抽提各組細胞總RNA，采用RT-PCR檢測各基因mRNA的表達。引物應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計，由上海英駿生物技術(shù)公司合成。NKX6.1上游5′-CCATCTTCTGGCCCGGAGT-3′，下游5′-CGGACG-CGTGCAGTAGGAG-3′，擴增片段480 bp，退火溫度55℃；insulin上游5′-AACCAACACCTGTGCGGC-TCA-3′，下游5′ -TGCCTGCGGGCTGCGTCTA-3′，擴增片段271 bp，退火溫度60℃；glut-2上游5′-GCGAATAAACAGGCAGGAGC-3′，下游5′-GCTGGATACAGACAGGGACC-3′ ，擴增片段392 bp，退火溫度53℃；ngn3上游5′-AAAGCGAGTTGGCACTAAGCA-3′，下游5′-CGTCTGGGAAGGTGGGAAGTA-3′，擴增片段132 bp，退火溫度57℃；PDX-1上游，5′-GGATGAAGTCTACCAAAGCTCACGC-3′，下游5′-CCAGATCTTGATGTGTCTCTCGGTC-3′，擴增片段230 bp，退火溫度60℃；內(nèi)參GAPDH上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，擴增片段285 bp，退火溫度58℃。

六、胰島素與C肽分泌量測定

取各組細胞培養(yǎng)液上清置-20℃保存待測。取誘導(dǎo)后胰島樣細胞團，洗滌2次后置無血清H-DMEM(含25 mmol/L葡萄糖)孵育1 h，取上清，置-20℃保存。采用化學(xué)發(fā)光法測定胰島素和C肽含量，試劑盒均購自美國Abbott Axsym System公司。實驗重復(fù)5次。

七、胰島素陽性細胞率檢測

取誘導(dǎo)第17天的細胞，胰蛋白酶消化、PBS洗滌后加insulin-Cy5，流式細胞儀計數(shù)105個細胞，測定胰島素陽性細胞率。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、人臍帶MSCs的形態(tài)和表面標志表達

單個核細胞培養(yǎng)48～72 h內(nèi)開始貼壁，細胞呈短梭形、多角形；7 d內(nèi)大部分細胞貼壁，呈短梭形；培養(yǎng)15 d接近80%融合，呈長梭形。傳到第4代時細胞形態(tài)均一，CD29+、CD44+細胞分別占98.7%和99.6%，而CD45+、CD34+、 HLADR+細胞僅分別占2.3%、1.6%和0.68%(圖1)。

圖1 第4代臍帶MSCs的形態(tài)及表面標志表達

二、重組病毒感染后MSCs的PDX1表達

感染72 h后臍帶MSCs表達GFP(圖2a)，感染率約90%。外源基因PDX1定位于細胞核(圖2b、c)。

圖2 重組病毒感染MSCs 7 d后GFP(a)及PDX1(b、c)表達

三、臍帶MSCs的誘導(dǎo)分化

重組病毒感染后聯(lián)合EGF、B27培養(yǎng)，細胞由長梭形逐漸變圓，相鄰細胞開始聚集，形成一個個由圓形或卵圓形細胞組成的細胞團，形如胰島小體樣結(jié)構(gòu)，再聯(lián)合其他因子培養(yǎng)后，細胞聚集更緊密(圖3a)，經(jīng)雙硫腙染成亮紅色(圖3b)；胞質(zhì)內(nèi)C肽被染成綠色(圖3c)； insulin被染成紅色(圖3d)。

圖3MSCs誘導(dǎo)后細胞的形態(tài)(a、b)及C肽(c)、胰島素(d)表達(免疫熒光 ×400)

四、胰島相關(guān)基因mRNA的表達

聯(lián)合組細胞在誘導(dǎo)0、7、10、17 d和17 d加高糖刺激1 h后均可檢測到胰島相關(guān)基因PDX1、ngn3、insulin、glut-2、NKX6.1 mRNA的表達(圖4)。

圖4 誘導(dǎo)后細胞胰島相關(guān)基因mRNA的表達(RT-PCR)

五、胰島素和C肽的分泌

Adxsi-CMV-PDX1組、空病毒+細胞因子組及對照組細胞培養(yǎng)不同時間及用高糖刺激，其胰島素分泌量均無明顯變化，波動在(3.6±2.4)mU/L～(4.5±3.7)mU/L。聯(lián)合組細胞誘導(dǎo)第10、17天時，培養(yǎng)液上清中胰島素含量顯著升高，高糖刺激1 h后，胰島素的分泌量更高(表1)。

只有聯(lián)合組在培養(yǎng)第10、17天表達C肽，分別為(0.13±0.04)ng/ml和(1.61±0.41)ng/ml，高糖刺激后C肽分泌高達(3.72±1.52)ng/ml，其他時段及其他各組細胞的培養(yǎng)上清液中均未檢測到C肽，差異顯著(P<0.05)。

表1 各組細胞各時段培養(yǎng)液上清中胰島素分泌量(X±SD, mU/L)

注：與其他組相比，aP<0.05

六、胰島素陽性細胞率

聯(lián)合組胰島素陽性細胞率為(11.6±4.8)%，對照組為0。兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

Kaneto等[6]報道，PDX1不能誘導(dǎo)MSCs表達胰島素mRNA。本實驗單獨用攜帶PDX1的重組腺病毒感染臍帶MSCs 17 d也未能檢測到胰島素mRNA。最新研究[7-10]已經(jīng)明確，從β前體細胞到成熟β細胞的發(fā)育過程除需PDX1之外，尚需NKX6.1、ngn3、Mafa、NKX2.2、Foxa1等轉(zhuǎn)錄因子的時序表達、相互作用，此外，許多細胞因子也可以促進這一分化過程[11-13]。

本實驗結(jié)果顯示，PDX1轉(zhuǎn)入MSCs 7 d后僅有ngn3 mRNA表達，聯(lián)合EGF與B27刺激3 d后，激活臍帶MSCs向β細胞定向分化所需的NKX6.1的表達，并啟動了胰島素mRNA的表達，細胞形狀與β細胞非常相似。經(jīng)雙硫腙染成亮紅色，說明誘導(dǎo)后的MSCs細胞的胞質(zhì)內(nèi)富含鋅離子,具備β細胞前體細胞的特征。再聯(lián)合其他因子誘導(dǎo)后細胞的胰島素水平和C肽分泌水平顯著升高，高糖刺激后胰島素分泌量更高，C肽分泌量也增加，glut2 mRNA也開始表達。

insulin、glut2、GK和Mafa是β細胞成熟的4個重要標志物，而ngn3在成熟的β細胞中并不表達。本實驗誘導(dǎo)的胰島樣細胞表達insulin、glut2和ngn3 mRNA，說明誘導(dǎo)的β細胞尚未完全成熟。有研究報道，轉(zhuǎn)入外源性PDX1、ngn3和Mafa 3個基因可以將成年鼠胰腺外分泌細胞分化為胰島β樣細胞，胰島素陽性細胞百分率可達20%[14]。因此，要提高誘導(dǎo)效率，還需要進一步優(yōu)化誘導(dǎo)方案。

[1] Jiang J,Au M,Lu K,et al.Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells.Stem Cells,2007,25:1940-1953.

[2] Segev H,Fishman B,Ziskind A,et al.Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters.Stem Cells,2004,22:265-274.

[3] Melloul D.Transcription factors in islet development and physiology:role of PDX-1 in beta-cell function.Ann NY Acad Sci USA,2004,1014:28-37.

[4] Kajiyama H,Hamazaki TS,Tokuhara M,et al.Pdx1-transfected adipose tissue-derived stem cells differentiate into insulin-producing cells in vivo and reduce hyperglycemia in diabetic mice.Int J Dev Biol,2010,54:699-705.

[5] Hisanaga E,Park KY,Yamada S,et al.A simple method to induce differentiation of murine bone marrow mesenchymal cells to insulin-producingcells using conophylline and betacellulin-delta4.Endocr J,2008,55:535-543.

[6] Kaneto H,Nakatani Y,Miyatsuka T,et al.PDX-1/VP16 fusion protein,together with neuroD or Ngn3,markedly induces insulin gene transcription and ameliorates glucose tolerance.Diabetes,2005,54:1009-1022.

[7] Wescott MP,Rovira M,Reichert M,et al.Pancreatic ductal morphogenesis and the Pdx1 homeodomain transcription factor.Mol Biol Cell,2009,20:4838-4844.

[8] Smith SB,Watada H,German MS.Neurogenin3 activates the islet differentiation program while repressing its own expression.Mol Endocrinol,2004,18:142-149.

[9] Mellitzer G,Bonne S,Luco RF,et al.IA1 is NGN3-dependent and essential for differentiation of the endocrine pancreas.EMBO J,2006,25:1344-1352.

[10] Song YD,Lee EJ,Yashar P,et al.Islet cell differentiation in liver by combinatorial expression of transcription factors Neurogenin-3,BETA2,and RIPE3b1.Biochem Biophys Res Commun,2007,354:334-339.

[11] Miettinen P,Ormio P,Hakonen E,et al.EGF receptor in pancreatic beta-cell mass regulation.Biochem Soc Trans,2008,36:280-285.

[12] Yasuda M,Yamamoto M,Ochiai H,et al.Effects of growth factors on development of fetal islet B-cells in vitro.J Vet Med Sci,2007,

69:807-811.

[13] Li L,Li F,Qi H,et al.Coexpression of Pdx1 and betacellulin in mesenchymal stem cells could promote the differentiation of nestin-positive epithelium-like progenitors and pancreatic islet-like spheroids.Stem Cells Dev,2008,17:815-823.

[14] Zhou Q,Brown J,Kanarek A,et al.In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.Nature,2008,455:627-632.

2010-07-26)

(本文編輯：屠振興)

PDX1geneandcytokinesinducehumanumbilicalcordmesenchymalstemcellstodifferentiateintoisletβ-likecellsinvitro

WANGBo,WUHan-qing,WUHe-shui,WANGChun-you.

DepartmentofPancreaticSurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WUHe-shui,Email:heshuiwu@163.com

ObjectiveTo explore the method how PDX1 gene modified mesenchymal stem cells (MSCs) from human umbilical cord can be differentiated into islet β-like cells in vitro.MethodsRecombined adenovirus vectors inserted with PDX1 (Adxsi-CMV-PDX1) was transfected into MSCs and multiple cytokines was combined to induce differentiation. The expressions of PDX1, insulin, ngn3, glut2, NKX6.1 were examined by RT-PCR and immunofluorescence staining. The levels of insulin and C peptide secretion were examined by chemiluminescence immunoassay. Flow cytometry was used to determine the positive rate of insulin cells.ResultsAfter Adxsi-CMV-PDX1 transfection and cytokines induction, MSCs were transformed from short spindle shape to long spindle shape and aggregated into islet-like cell clusters. Dithizone staining of these cells showed bright red color. PDX1, ngn3, NKX6.1, insulin, glut 2 mRNA were expressed in cells 17d after induction. Insulin and C peptide were expressed in cytoplasm. The levels of insulin and C peptide in cell culture supernatant were (473.1±51.5)mU/L and (1.61±0.41)ng/ml; the levels of insulin and C peptide secretion were (964.4±68.1)mU/L, (3.72±1.52) ng/mL, respectively, with 25 mmol/L glucose stimulation for one hour. Insulin (+) cells rate (11.6±4.8)%.ConclusionsAdxsi-CMV-PDX1 combined with cytokines can induce MSCs from human umbilical cord to differentiate into islet β-like cells. They can secret insulin and C peptide, and have the sensitivity to the stimulation of glucose.

Umbilical cord; Mesenchymal stem cells; Pancreatic and duodenal homeobox factor;Islet β-like cells; Cell differentiation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.015

430022 湖北武漢，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科

吳河水，Email:heshuiwu@163.com