γ-氨基丁酸、印防己毒素對(duì)γ δT細(xì)胞表面受體表達(dá)及對(duì)胰腺癌細(xì)胞殺傷力的影響

王營(yíng) 劉世育 費(fèi)素娟 陳復(fù)興 劉軍權(quán)

·短篇論著·

γ-氨基丁酸、印防己毒素對(duì)γ δT細(xì)胞表面受體表達(dá)及對(duì)胰腺癌細(xì)胞殺傷力的影響

王營(yíng) 劉世育 費(fèi)素娟 陳復(fù)興 劉軍權(quán)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且廣泛存在于外周神經(jīng)組織及非神經(jīng)組織的細(xì)胞中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+和(或)CD8+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)GABA的A受體，GABA與其結(jié)合能夠抑制抗原特異性T細(xì)胞活化，具有免疫抑制作用[2]。γ δT細(xì)胞是固有免疫的一個(gè)重要細(xì)胞群，廣泛分布于消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)上皮組織內(nèi),末梢血中也有一定的數(shù)量。γ δT細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系具有殺傷作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GABA及其A受體拮抗劑印防己毒素(picrotoxin,PTX)誘導(dǎo)人γ δT細(xì)胞，觀察誘導(dǎo)后γ δT細(xì)胞表面受體的表達(dá)和對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷力，探討其機(jī)制。

一、材料與方法

1．細(xì)胞的培養(yǎng)：取健康獻(xiàn)血者末梢抗凝血10 ml,加入淋巴細(xì)胞分離液，2000 r/min離心15 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，生理鹽水洗滌3遍后加入RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清、5%人AB血清、IPP 3 ng/ml和IL-2 100 IU/ml)中常規(guī)培養(yǎng)。收集培養(yǎng)10 d的γ δT細(xì)胞。人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

2．流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)表面受體γ δ-TCR和NKG2D的γ δT細(xì)胞：取培養(yǎng)10 d的γ δT細(xì)胞1×109個(gè)/L接種于96孔板,每孔0.2 ml 。培養(yǎng)24 h后分為200、800、3200 μmol/L GABA組，100 μmol/L PTX組和GABA(200 μmol/L)+PTX(100 μmol/L)組,每組分別加入熒光標(biāo)記的抗人TCR -γδ-FITC單抗、抗人NKG2D-PE抗體(法國(guó)Immunotech公司)，終濃度為5 μg/ml,以不加抗體作為對(duì)照組，4℃避光孵育20 min,PBS液洗滌,然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3．LDH法檢測(cè)γ δT細(xì)胞對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷率：將上述各組γ δT細(xì)胞與SW1990細(xì)胞數(shù)按10∶1比例混合作為測(cè)定管，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放管(SW1990細(xì)胞+0.5%BSA-RPMI164)及最大釋放管(SW1990細(xì)胞+1%NP40),每組4個(gè)復(fù)管。常規(guī)孵育5 h后輕輕混勻細(xì)胞，再離心收集上清液，用Encore全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定LDH的活性單位(U/L)。γ δT細(xì)胞殺傷率=(測(cè)定管LDH單位-靶細(xì)胞自然釋放LDH單位)/(最大釋放管LDH單位-靶細(xì)胞自然釋放管LDH單位)×100%。

二、結(jié)果

1．GABA及PTX對(duì)γ δT細(xì)胞表面受體表達(dá)的影響：GABA呈濃度依賴性促進(jìn)γ δT細(xì)胞表面γ δ-TCR表達(dá)，PTX亦促進(jìn)γ δ-TCR表達(dá)，兩者聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步促進(jìn)γ δ-TCR表達(dá)(P<0.05)。200 μmol/L GABA促進(jìn)γ δT細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)，但高濃度GABA抑制NKG2D表達(dá)，PTX亦抑制NKG2D表達(dá)，兩者聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步抑制NKG2D表達(dá)。3200 μmol/L GABA組顯著增加γ δ-TCR和NKG2D的雙表達(dá)；PTX亦可增加γ δ-TCR和NKG2D的雙表達(dá)，但兩種聯(lián)合應(yīng)用未進(jìn)一步增加γ δ-TCR和NKG2D的雙表達(dá)(P值<0.05或0.01，表1)。

表1 各組表達(dá)表面受體γ δ-TCR、NKG2D的γ δT細(xì)胞百分比及對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷率

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.05

2．GABA及PTX對(duì)γ δT細(xì)胞殺傷SW1990細(xì)胞的影響：GABA誘導(dǎo)后，γ δT細(xì)胞對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷力明顯被抑制；PTX誘導(dǎo)后，γ δT細(xì)胞對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷力明顯增加，與GABA聯(lián)合應(yīng)用，則可減輕GABA誘導(dǎo)所引起的抑制作用(P<0.05或<0.01，表1)。

討論γ δ-TCR和NKG2D是γ δT細(xì)胞表達(dá)的兩個(gè)主要與炎癥、腫瘤等免疫相關(guān)的受體。高表達(dá)CD44的γ δT細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞黏附,有效殺傷靶細(xì)胞,這與腫瘤細(xì)胞的γ δTCR刺激物和γ δT細(xì)胞的NKG2D受體表達(dá)水平密切相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GABA及其A受體拮抗劑PTX均能促進(jìn)γ δT細(xì)胞上γ δ-TCR的表達(dá)，降低NKG2D的表達(dá)，但γ δ-TCR和NKG2D雙表達(dá)細(xì)胞增加，提示它們促進(jìn)γ δ-TCR表達(dá)的作用強(qiáng)于抑制NKG2D的表達(dá)，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

研究表明[6]，在一定的效靶比時(shí)γ δT細(xì)胞體外對(duì)胰腺癌細(xì)胞有巨大的殺傷活性。本結(jié)果顯示，GABA可以抑制γ δT細(xì)胞對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷力，并呈劑量依賴性，與NKG2D表達(dá)降低程度呈正相關(guān)；而PTX可促進(jìn)γ δT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，提示γ δT細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞主要是通過(guò)其表面受體NKG2D介導(dǎo)的。

[1] Watanabe M, Maemura K, Kanbara K,et al. GABA and GABA receptors in the central nervous system and other organs. Int Rev Cytol,2002, 213:1-47.

[2] Alam S, Laughton DL，Walding A, et al. Wolstenholme. Human peripheral blood mononuclear cells express GABAA receptor subunits. Mol Immunol，2006，43：1432-1442.

[3] 陳復(fù)興，劉軍權(quán)，馮霞，等.人末梢血γδT細(xì)胞對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用.世界華人消化雜志,2007,15：111-116.

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2010-09-15)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.022

徐州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(XZZD0818)

江蘇省徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科(王營(yíng)、費(fèi)素娟)；江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院消化科(劉世育)；中國(guó)人民解放軍第九七醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科(陳復(fù)興、劉軍權(quán))

王營(yíng)，Email:wangyingxu20@21cn.com