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    γ-氨基丁酸、印防己毒素對(duì)γ δT細(xì)胞表面受體表達(dá)及對(duì)胰腺癌細(xì)胞殺傷力的影響

    2011-11-22 01:07:17王營(yíng)劉世育費(fèi)素娟陳復(fù)興劉軍權(quán)
    中華胰腺病雜志 2011年3期
    關(guān)鍵詞:殺傷力靶細(xì)胞胰腺癌

    王營(yíng) 劉世育 費(fèi)素娟 陳復(fù)興 劉軍權(quán)

    ·短篇論著·

    γ-氨基丁酸、印防己毒素對(duì)γ δT細(xì)胞表面受體表達(dá)及對(duì)胰腺癌細(xì)胞殺傷力的影響

    王營(yíng) 劉世育 費(fèi)素娟 陳復(fù)興 劉軍權(quán)

    γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),而且廣泛存在于外周神經(jīng)組織及非神經(jīng)組織的細(xì)胞中[1]。研究發(fā)現(xiàn),CD4+和(或)CD8+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)GABA的A受體,GABA與其結(jié)合能夠抑制抗原特異性T細(xì)胞活化,具有免疫抑制作用[2]。γ δT細(xì)胞是固有免疫的一個(gè)重要細(xì)胞群,廣泛分布于消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)上皮組織內(nèi),末梢血中也有一定的數(shù)量。γ δT細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系具有殺傷作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GABA及其A受體拮抗劑印防己毒素(picrotoxin,PTX)誘導(dǎo)人γ δT細(xì)胞,觀察誘導(dǎo)后γ δT細(xì)胞表面受體的表達(dá)和對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷力,探討其機(jī)制。

    一、材料與方法

    1.細(xì)胞的培養(yǎng):取健康獻(xiàn)血者末梢抗凝血10 ml,加入淋巴細(xì)胞分離液,2000 r/min離心15 min,吸取單個(gè)核細(xì)胞層,生理鹽水洗滌3遍后加入RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清、5%人AB血清、IPP 3 ng/ml和IL-2 100 IU/ml)中常規(guī)培養(yǎng)。收集培養(yǎng)10 d的γ δT細(xì)胞。人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所,常規(guī)培養(yǎng)傳代。

    2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)表面受體γ δ-TCR和NKG2D的γ δT細(xì)胞:取培養(yǎng)10 d的γ δT細(xì)胞1×109個(gè)/L接種于96孔板,每孔0.2 ml 。培養(yǎng)24 h后分為200、800、3200 μmol/L GABA組,100 μmol/L PTX組和GABA(200 μmol/L)+PTX(100 μmol/L)組,每組分別加入熒光標(biāo)記的抗人TCR -γδ-FITC單抗、抗人NKG2D-PE抗體(法國(guó)Immunotech公司),終濃度為5 μg/ml,以不加抗體作為對(duì)照組,4℃避光孵育20 min,PBS液洗滌,然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    3.LDH法檢測(cè)γ δT細(xì)胞對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷率:將上述各組γ δT細(xì)胞與SW1990細(xì)胞數(shù)按10∶1比例混合作為測(cè)定管,同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放管(SW1990細(xì)胞+0.5%BSA-RPMI164)及最大釋放管(SW1990細(xì)胞+1%NP40),每組4個(gè)復(fù)管。常規(guī)孵育5 h后輕輕混勻細(xì)胞,再離心收集上清液,用Encore全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定LDH的活性單位(U/L)。γ δT細(xì)胞殺傷率=(測(cè)定管LDH單位-靶細(xì)胞自然釋放LDH單位)/(最大釋放管LDH單位-靶細(xì)胞自然釋放管LDH單位)×100%。

    二、結(jié)果

    1.GABA及PTX對(duì)γ δT細(xì)胞表面受體表達(dá)的影響:GABA呈濃度依賴性促進(jìn)γ δT細(xì)胞表面γ δ-TCR表達(dá),PTX亦促進(jìn)γ δ-TCR表達(dá),兩者聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步促進(jìn)γ δ-TCR表達(dá)(P<0.05)。200 μmol/L GABA促進(jìn)γ δT細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá),但高濃度GABA抑制NKG2D表達(dá),PTX亦抑制NKG2D表達(dá),兩者聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步抑制NKG2D表達(dá)。3200 μmol/L GABA組顯著增加γ δ-TCR和NKG2D的雙表達(dá);PTX亦可增加γ δ-TCR和NKG2D的雙表達(dá),但兩種聯(lián)合應(yīng)用未進(jìn)一步增加γ δ-TCR和NKG2D的雙表達(dá)(P值<0.05或0.01,表1)。

    表1 各組表達(dá)表面受體γ δ-TCR、NKG2D的γ δT細(xì)胞百分比及對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷率

    注:與對(duì)照組比較,aP<0.05,bP<0.01,cP<0.05

    2.GABA及PTX對(duì)γ δT細(xì)胞殺傷SW1990細(xì)胞的影響:GABA誘導(dǎo)后,γ δT細(xì)胞對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷力明顯被抑制;PTX誘導(dǎo)后,γ δT細(xì)胞對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷力明顯增加,與GABA聯(lián)合應(yīng)用,則可減輕GABA誘導(dǎo)所引起的抑制作用(P<0.05或<0.01,表1)。

    討論γ δ-TCR和NKG2D是γ δT細(xì)胞表達(dá)的兩個(gè)主要與炎癥、腫瘤等免疫相關(guān)的受體。高表達(dá)CD44的γ δT細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞黏附,有效殺傷靶細(xì)胞,這與腫瘤細(xì)胞的γ δTCR刺激物和γ δT細(xì)胞的NKG2D受體表達(dá)水平密切相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GABA及其A受體拮抗劑PTX均能促進(jìn)γ δT細(xì)胞上γ δ-TCR的表達(dá),降低NKG2D的表達(dá),但γ δ-TCR和NKG2D雙表達(dá)細(xì)胞增加,提示它們促進(jìn)γ δ-TCR表達(dá)的作用強(qiáng)于抑制NKG2D的表達(dá),其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

    研究表明[6],在一定的效靶比時(shí)γ δT細(xì)胞體外對(duì)胰腺癌細(xì)胞有巨大的殺傷活性。本結(jié)果顯示,GABA可以抑制γ δT細(xì)胞對(duì)SW1990細(xì)胞的殺傷力,并呈劑量依賴性,與NKG2D表達(dá)降低程度呈正相關(guān);而PTX可促進(jìn)γ δT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力,提示γ δT細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞主要是通過(guò)其表面受體NKG2D介導(dǎo)的。

    [1] Watanabe M, Maemura K, Kanbara K,et al. GABA and GABA receptors in the central nervous system and other organs. Int Rev Cytol,2002, 213:1-47.

    [2] Alam S, Laughton DL,Walding A, et al. Wolstenholme. Human peripheral blood mononuclear cells express GABAA receptor subunits. Mol Immunol,2006,43:1432-1442.

    [3] 陳復(fù)興,劉軍權(quán),馮霞,等.人末梢血γδT細(xì)胞對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用.世界華人消化雜志,2007,15:111-116.

    [4] Kabelitz D, Wesch D, He W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.Cancer Res,2007,67:5-8.

    [5] Corvaisier M, Moreau Aubry A, Diez E,et al. V gamma 9V delta 2 T cell response to colon carcinoma cells. J Immunol,2005, 175: 5481-5488.

    [6] 戴夢(mèng)華, 何維, 趙玉沛. 外周血αβT和γδT細(xì)胞對(duì)胰腺癌細(xì)胞株的殺傷作用.中華肝膽外科雜志.2006, 12:440-443.

    2010-09-15)

    (本文編輯:呂芳萍)

    10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.022

    徐州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(XZZD0818)

    江蘇省徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科(王營(yíng)、費(fèi)素娟);江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院消化科(劉世育);中國(guó)人民解放軍第九七醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科(陳復(fù)興、劉軍權(quán))

    王營(yíng),Email:wangyingxu20@21cn.com

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