微波水解-HPAEC-PAD法快速測定乳粉中的皮革水解蛋白

(1.寧波海關(guān)技術(shù)中心，寧波 315012 ；2.浙江工商大學(xué),杭州 310018)

動(dòng)物皮革水解蛋白是將皮革邊角、甚至動(dòng)物毛發(fā)等下腳料，經(jīng)加工后制成的水解蛋白質(zhì)。某些非法廠家為降低生產(chǎn)成本，在乳粉中摻入廉價(jià)的水解動(dòng)物蛋白來冒充或替代乳蛋白質(zhì)[1]。但皮革下腳料中含有金屬鉻，長期食用含有“動(dòng)物皮革水解蛋白”的食物，易引起重金屬中毒。為此，國家衛(wèi)生部于2009年2月公布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單(第二批)》的通知中明確規(guī)定乳及乳制品、含乳飲料中禁止添加皮革水解蛋白。而羥脯氨酸則是皮革的主體蛋白-膠原蛋白中特有的氨基酸[2]。而乳蛋白質(zhì)則不含羥脯氨酸，因此常將羥脯氨酸含量作為奶粉及乳飲料產(chǎn)品摻假與否的證據(jù)。

樣品的前處理方法對后期的檢測尤為重要[3]，水解蛋白質(zhì)常見的方法有酶水解、酸水解和堿水解。其中酶水解因成本高而很少使用，堿水解會(huì)使部分氨基酸發(fā)生旋光異構(gòu)，酸水解較徹底，且不引起消旋，是較為常用的方法，耗時(shí)較長[4]。微波酸水解最新發(fā)展的快速、徹底的一種前處理手段。

羥脯氨酸的測定方法很多，主要有比色法、氨基酸自動(dòng)分析儀測定法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等[5-10]。其中比色法[8]操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，但缺乏分離手段，易出現(xiàn)假陽性。液相色譜法、氨基酸分析儀都經(jīng)過衍生后方可被檢測，而衍生試劑容易污染環(huán)境，不符合綠色化學(xué)的理念[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)采用微波水解作為樣品前處理方法，使水解時(shí)間從傳統(tǒng)法的16 h縮短至30 min。L-羥脯氨酸的檢測采用ICS-5000離子色譜儀，以AminoPacTMPA10陰離子交換柱為分離柱，采用梯度洗脫，脈沖安培檢測。該方法樣品處理簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可大致反映乳粉中皮革水解蛋白的添加量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與耗材

Thermo ICS-5000離子色譜儀(包括DP四元梯度泵和SP單泵，DC控制單元，EG淋洗液發(fā)生器，AS自動(dòng)進(jìn)樣器)、Chromeleon 6.8色譜工作站、Milli-Q Direct超純水系統(tǒng)(美國默克密理博公司)；DGG-9053AD 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋；723 PCS可見分光光度計(jì)、TOPEX 全能型微波化學(xué)工作平臺(tái)(上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司)；Vortex-Genie 2 漩渦混合器；SK8210HP 超聲波清洗器；SARTORIOUS QUINTIX213-1CN 電子天平；Mettler Toledo XS205 DualRange 分析天平；Eppendorf Research移液槍(20～200 μL，500～1000 μL，5000 μL)。

NaOH(Fluka)、乙酸鈉(Thermo)為色譜純；L-羥脯氨酸(Sigma)為優(yōu)級(jí)純；氫氧化鈉、冰乙酸、鹽酸，硫酸、4-(二甲氨基)苯甲醛、明膠、氯胺-T、正丙醇、異丙醇、三氯乙酸、一水檸檬酸、無水乙酸鈉均為滬試分析純。

Bond Elut C18柱(Agilent)；WondaDisc水系針頭濾器 MCE 0.22 μm(Shimadzu-GL)。

1.2 樣品預(yù)處理

1.2.1 傳統(tǒng)烘箱酸水解法

在50 mL塑料離心管中加入0.4 g乳粉、500 μL明膠溶液(15 g/L)、6 mL硫酸溶液(3 mol/L)，蓋緊管蓋，隨后在漩渦混合器中混合均勻。在105 ℃烘箱中放置16 h，反應(yīng)完畢，取出離心管，趁熱加水至40 mL，待冷卻用水定容。

1.2.2 微波酸水解法

在聚四氟乙烯反應(yīng)罐中加入0.4 g乳粉、500 μL明膠溶液(15 g/L)、6 mL硫酸溶液(3 mol/L)，蓋緊罐頂，置于微波消解器中，設(shè)置溫度梯度為100 ℃水解1 min、155 ℃水解30 min。反應(yīng)完畢，取出反應(yīng)罐，將水解液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，隨后用30 mL水分3次洗滌反應(yīng)罐，待冷卻后用水定容。

1.3 離子色譜法

水解液振蕩均勻，先過C18柱，取濾液，濾液稀釋100倍，再用0.22 μm水系膜過濾，上機(jī)。

色譜條件：色譜柱：DionexAminoPacTMPA10分析柱(2 mm×250 mm)，AminoPacTMPA10保護(hù)柱(2 mm×50 mm)；檢測器：脈沖安培檢測器，金工作電極，pH參比電極，氨基酸檢測電位；流速：0.25 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：25 μL。淋洗液梯度程序見表1。

表1 淋洗液梯度程序

2 結(jié)果與討論

2.1 微波酸水解樣品預(yù)處理

2.1.1 酸種類的確定

在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，同為16 h的烘箱酸水解，采用鹽酸水解的缺點(diǎn)也是顯而易見的，即容易揮發(fā)導(dǎo)致水解不徹底。而采用硫酸水解過程中，因水分蒸發(fā)而會(huì)引起樣品碳化，因此采用溫度梯度的水解方式，減少水分蒸發(fā)。

2.1.2 微波水解溫度探索

本實(shí)驗(yàn)采用溫度梯度的水解方法[11]，即梯度一為100 ℃水解1 min，梯度二為水解溫度和時(shí)間的變量，在梯度二中設(shè)置水解時(shí)間為5 min，以盡可能減少樣品的碳化。采用1.3比色法測定L-羥脯氨酸的含量，比較120、140、145、150、155和160 ℃下樣品的水解程度，結(jié)果表明，在155 ℃下樣品的水解效果較好(見圖1所示)。

圖1 L-羥脯氨酸與水解溫度的關(guān)系

2.1.3 微波水解時(shí)間探索

確定最佳微波水解溫度為155 ℃后，同2.1.2方法對微波水解時(shí)間進(jìn)行探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水解時(shí)間在30 min時(shí)，水解效果較好(見圖2所示)。值得注意的是，除了30 min水解時(shí)間點(diǎn)外，其余時(shí)間點(diǎn)的樣品可能由于未徹底水解或過水解，導(dǎo)致同一水平間，其平行性較差。

圖2 L-羥脯氨酸與水解時(shí)間的關(guān)系

2.2 離子色譜法測定L-羥脯氨酸的研究

2.2.1 NaOH淋洗梯度程序的選擇

對NaOH淋洗液淋洗條件進(jìn)行試驗(yàn)，采用18%

NaOH溶液(0.25 mol/L)和82%水作為梯度洗脫的初始程序分離度最好，假陽性現(xiàn)象降到最低水平。

2.2.3 線性關(guān)系

分別配制L-羥脯氨酸含量為0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.150 mg/L、0.200 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4節(jié)方法進(jìn)行測定，以峰面積值(y，nC·min)對濃度(x，mg/L)進(jìn)行線性回歸，得線性方程y=18.42707x，r2=0.9999。

2.2.4 加標(biāo)回收率、檢出限及定量限

按1.2.2水解方法將15 g/L明膠溶液分別替換為0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.200 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定其回收率，并作6次平行。結(jié)果表明回收率分別在92.91 %、102.55 %、94.51 %，標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.91 %、5.34 %、1.30 %，加標(biāo)回收率和重復(fù)性都較好。根據(jù)3倍基線噪音，確定檢出限(LOD)為0.015 mg/L，定量限(LOQ)為0.050 mg/L。

2.3 方法比較與樣品測定

微波酸水解-離子色譜法與傳統(tǒng)的烘箱酸水解-比色法相比較。

表2表明，在120 ℃以上水解，兩種測定方法計(jì)算數(shù)值較為接近，說明兩種測定方法較為接近。

表3以比色作為檢測方法，判斷兩種前處理方法是否對L-羥脯氨酸有破壞，從回收率來看，兩種前處理方法對L-羥脯氨酸的影響較小。

表2 用微波酸水解法作為樣品前處理方法，比較兩種檢測方法

表3 用比色法作為檢測方法，比較兩種樣品前處理方法

3 結(jié)論

采用微波酸水解法對樣品進(jìn)行前處理，HPAEC-PAD檢測，探索了水解溫度、時(shí)間的影響，并優(yōu)化了離子色譜的梯度淋洗程序，采用基于Au工作電極和pH參比電極的氨基酸檢測電位、AminoPacTMPA10分離柱對水解液中的L-羥脯氨酸進(jìn)行檢測，方法靈敏度較國標(biāo)法高，穩(wěn)定性好。該方法通過L-羥脯氨酸的含量的分析初篩測定乳粉中添加的皮革水解蛋白，為乳粉摻假提供了有益的檢測新方法。