超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析沿海貝類產(chǎn)品中的麻痹性貝毒

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究室，舟山316021;2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310035;3.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)漁場(chǎng)漁業(yè)資源科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，舟山316021;4.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，舟山 316022))

麻痹性貝毒(paralytic shellfish poisonings，PSP)是由海洋中貝類通過非選擇性濾食有毒海藻或其孢子，經(jīng)食物鏈蓄積、轉(zhuǎn)化生成的一類四氫嘌呤衍生物[1]。在多種貝類毒素中，PSP危害最大、發(fā)生頻率最高、分布范圍最廣，嚴(yán)重威脅人類健康[2]。聯(lián)合國衛(wèi)生組織規(guī)定貝類可食用部分的PSP含量不得超過800μg STXeq/kg[3]。

目前PSP測(cè)定方法主要有小鼠生物法、ELISA法、細(xì)胞毒性測(cè)試法、毛細(xì)管電泳法[4]、液相色譜法[5]和液質(zhì)聯(lián)用法[6]。小鼠生物法無法定量毒素組分，ELISA法易產(chǎn)生假陽性，細(xì)胞毒性測(cè)試法難以迅速普及，毛細(xì)管電泳法適用性有限，液相色譜法前處理復(fù)雜。液質(zhì)聯(lián)用法可同時(shí)提供定性定量信息，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物及環(huán)境中PSP的監(jiān)測(cè)。本研究以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)為分析手段，對(duì)沿海省份6類共99批次貝類產(chǎn)品中13種PSP進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，為了解PSP在食用貝類中的污染和分布情況提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扇貝、貽貝、牡蠣等貝類產(chǎn)品，購買于沿海各省市的流通市場(chǎng)和養(yǎng)殖區(qū)；PSP標(biāo)準(zhǔn)品購買于加拿大海洋生物科學(xué)研究所；乙酸：優(yōu)級(jí)純，上海國藥集團(tuán)；氨水：色譜純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司；乙腈：色譜純，德國Meker公司；甲酸：色譜純，上海國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(美國Water公司)；石墨化碳黑固相萃取柱(250mg/3mL，美國Supelco公司)；Centrifuge5810高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品前處理參考文獻(xiàn)[7]：稱取5g均質(zhì)試樣于50mL離心管中，加入5mL1%乙酸水溶液，渦旋混合90s，密封置于沸水浴5min，取出于流水冷卻至室溫。混合物4500r/min離心10min，取上清液1mL于2mL離心管中，加入5μL氨水，渦旋混勻后10000r/min離心5min。

依次用3mL乙腈、3mL20%乙腈水溶液(含1%乙酸)、3mL0.1%氨水溶液活化石墨化碳黑固相萃取柱，500μL提取液上樣，700μL超純水淋洗，最后用1mL75%乙腈水溶液(含0.25%甲酸)洗脫收集于2mL離心管中。洗脫液過0.22μm濾膜于進(jìn)樣小瓶中，4°C下保存，供UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH Amide(2.1×100mm，1.7μm)；流動(dòng)相A：水/甲酸/氨水(500:0.075:0.3，v/v/v)，流動(dòng)相B：乙腈/水/甲酸(700:300:0.1，v/v/v)；梯度洗脫程序：0～2.0min，4%A；2.0～4.0min，4～30%A；4.2～6.0min，30～65%A；6.2～8.0min，65～4%A；柱溫40℃；樣品溫度4℃；進(jìn)樣體積10μL；流速0.4mL/min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：電噴霧離子(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，正負(fù)離子切換模式；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度600℃；脫溶劑氣流量1000L/h；錐孔氣流量150L/h。其中STX、NEO、dcSTX、dcNEO采用ESI+，毛細(xì)管電壓1.0kV，錐孔電壓10V；其他目標(biāo)物采用ESI-，毛細(xì)管電壓2.7kV；錐孔電壓40V；定性、定量離子對(duì)及其他參數(shù)見表1。

表1 麻痹性貝毒質(zhì)譜參數(shù)

續(xù)表1

1.4 毒性轉(zhuǎn)換

STX毒素的毒性因子設(shè)為1，其他各種毒素按照毒性因子，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為STXeq來表示，計(jì)算公式為：

式中：Xi，各種PSP的含量，μg/kg；ri，毒性因子。麻痹性貝毒毒性因子見表2。

表2 麻痹性貝毒毒性因子

2 結(jié)果與分析

2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

PSP屬于強(qiáng)極性化合物，其中C1與C2、GTX1與GTX4、GTX2與GTX3、dcGTX2與dcGTX3互為同分異構(gòu)體。本法前處理參考吳海燕等[7]，樣品采用1%乙酸水溶液提取、石墨化碳黑固相萃取柱凈化；但目標(biāo)物經(jīng)氨基柱分離，MRM模式檢測(cè)。吳海燕采用TSK柱對(duì)PSP進(jìn)行洗脫，保留時(shí)間在5.85到6.17min之間；本文利用流動(dòng)相的酸堿度變化，結(jié)合梯度洗脫，可在8min內(nèi)實(shí)現(xiàn)13種PSP的有效分離，保留時(shí)間在1.97到4.74min之間，具有可比性。

方法采用空白基質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，13種目標(biāo)物在4～722ng/mL線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.996，檢出限為4～14μg/kg。方法回收率為60～105%，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3～16%和5～17%(n=3)。本方法靈敏度、回收率與精密度良好，適用于各種貝類產(chǎn)品中PSP的檢測(cè)(表3)。

表3 麻痹性貝毒方法學(xué)參數(shù)

續(xù)表3

2.2 沿海貝類中麻痹性貝毒的監(jiān)測(cè)情況

對(duì)沿海六省一市采集的99批次貝類產(chǎn)品進(jìn)行分析，共檢出PSP陽性樣品17批次(圖1)，分布于浙江、江蘇、遼寧三省，其檢出率分別為46.67%、35.71%、33.33%。孫燁[8]統(tǒng)計(jì)2000～2015年P(guān)SP食品中毒事件，發(fā)現(xiàn)浙江省中毒案列高于其他各省，與本結(jié)果基本相符。

比較采樣時(shí)間(圖2)對(duì)PSP檢出率的影響，發(fā)現(xiàn)6月檢出率高達(dá)68.75%，7月和9月檢出率在18.75%～21.43%間。夏秋兩季是赤潮的高發(fā)季節(jié)，貝類濾食有毒藻類的幾率增加，PSP檢出率隨之增加。本次調(diào)查的貝類產(chǎn)品覆蓋面廣，采集時(shí)間較為分散，后期應(yīng)合理增加采樣頻次，以便全面評(píng)價(jià)不同貝類中PSP的安全風(fēng)險(xiǎn)。

圖1 各省份貝類產(chǎn)品中麻痹性貝毒的檢出情況

圖2 各采集時(shí)間貝類產(chǎn)品中麻痹性貝毒的檢出情況

圖3 不同品種貝類產(chǎn)品中麻痹性貝毒的檢出情況

由圖3可見，6種貝類產(chǎn)品中共有4種貝類產(chǎn)品中有PSP檢出，貽貝、泥蚶、毛蚶、扇貝檢出率依次降低，分別為38.89%、23.53%、23.08%、16.67%。如表4所示，17批次陽性貝類的PSP含量在66.9～1635.5μg STXeq/kg之間，其中3批次泥蚶的PSP含量超過了聯(lián)合國衛(wèi)生組織的安全限值。圖4為陽性泥蚶樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)品中13種PSP的定量MRM色譜圖。

表4 陽性貝類樣品中的麻痹性貝毒含量

續(xù)表4

圖4 (A)陽性泥蚶樣品和(B)混合標(biāo)準(zhǔn)品中麻痹性貝毒的MRM色譜圖

2.2 陽性貝類中麻痹性貝毒的分布情況

PSP中STX毒性最高，其他多種毒素均通過轉(zhuǎn)換成STX當(dāng)量來表示；NEO的毒力僅次于STX，這兩種毒素是PSP監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)[9]。本次監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)在13種PSP中STX、GTX5和dcSTX的檢出率較高，分別達(dá)到82%、71%和71%，而NEO的檢出率為41%，與之前文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9，10]。

通過毒性轉(zhuǎn)化公式將陽性樣品中的各毒素統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為STXeq，并計(jì)算其在總毒素(∑STXeq)中所占的百分比(圖5)。從毒素組成分析來看，陽性毛蚶中PSP主要以STX(58～88%)形式存在，還有少量的dcGTX3、GTX5和GTX3(均<5%)；其中2批次樣品還含有一定量的dcSTX(11%和36%)。陽性泥蚶中PSP主要以dcSTX(43～75%)、STX(12-22%)為主，此外還含有微量的C1、C2(均<7%)；其中有2批次含有少量GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX3(均<10%)。陽性扇貝中PSP以GTX5(31～38%)、STX(34～38%)為主要存在形式，同時(shí)含有微量dcSTX(均<6%)；其中2批次樣品中GTX4的含量分別達(dá)到21%和25%。

在7批次的陽性貽貝中，PSP存在形式差異較大，其中1批次樣品僅含有C1一種毒素；1批次樣品含有STX(50%)、GTX1(29%)、NEO(18%)及微量GTX2(3%)；2批次樣品特征相似，主要以C2(25%和26%)、dcSTX(24和25%)和NEO(20%和25%)為主，此外還含有微量GTX2、GTX5、dcGTX3、STX(3-9%)；1批次樣品主要含NEO(30%)、GTX3(20%)、dcSTX(18%)和dcGTX3(10%)，及微量C1、GTX2、GTX5、STX(2～8%)；1批次樣品以NEO(67%)和GTX3(15%)為主，同時(shí)有少量C1、GTX2、GTX5(總比<18%)；1批次樣品主要以dcGTX3(28%)、C1(25%)、GTX1(23%)、GTX5(19%)形式存在，及少量dcGTX2(5%)。

圖5 陽性貝類樣品中麻痹性貝毒分布情況

3 結(jié)論

采用UPLC-MS/MS方法進(jìn)行了沿海貝類產(chǎn)品中13種PSP的定性定量分析，本方法靈敏度高、分析速度快、重現(xiàn)性好，可廣泛適用于各類貝類產(chǎn)品中麻痹性貝毒的檢測(cè)。