豚鼠COPD模型MMP-9和TIMP-1的表達(dá)及吸入糖皮質(zhì)激素對其表達(dá)的影響

段珊 鄧立普

慢性阻塞性肺疾病是以“不完全可逆的氣流受限”為特征的慢性氣道炎癥性疾病。目前認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制物(TIMPs)，在COPD發(fā)生發(fā)展中起重要作用。MMP-9屬于MMPs家族中明膠酶類，是降解Ⅳ型膠原的最主要成員之一。而TIMP-1是MMP-9重要的生理性抑制劑。本試驗擬檢測COPD模型MMP-9和TIMP-1的表達(dá)，通過布地奈德干預(yù)豚鼠COPD模型的研究，了解其對肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 模型制備 健康豚鼠，雌雄對半，體重(200±20)g，共18只，隨機分成:(1)COPD模型組12只，分為2小組，每小組各6只，其中一組無藥物干預(yù)和布地奈德組;(2)正常對照組6只。將三組模型組豚鼠分別放入三個90×60×90 cm(容積486L)自制熏箱內(nèi)，箱側(cè)壁留有直徑約2 cm的通風(fēng)孔。在通風(fēng)口處放一小型電扇。豚鼠暴露于煙霧中進(jìn)行被動吸煙，2次/d，每次10支香煙，持續(xù)1～1.5 h，兩次被動吸煙間隔4 h，每周被動吸煙5 d，連續(xù)3個月。

1.2 藥物干預(yù) 將布地奈德組豚鼠放入20×30×40 cm塑料箱內(nèi)，箱側(cè)壁留有直徑約1.5 cm的通風(fēng)孔。布地奈德霧化液通過超聲霧化器(由南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院提供)導(dǎo)入箱內(nèi)。2次/d，一次加入生理鹽水20 ml+布地奈德1 ml(0.5 mg/ml)，霧化時間約30 min。

1.3 病理標(biāo)本采集及染色 豚鼠斷頭放血處死，打開胸腔取右下肺及相連的支氣管，用生理鹽水沖洗肺表面，然后浸入10%福爾馬林中固定24 h，取右下肺葉最大橫徑約3 mm厚組織及支氣管分叉上0.5 cm氣管橫、縱截面標(biāo)本，脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。行HE染色和免疫組化。

1.4 免疫組化染色 參照試劑盒推薦鏈酶卵白素-過氧化物酶免疫組化法，應(yīng)用SP9003免疫組化試劑盒(中山公司)和DAB顯色法。MMP-9、TIMP-1羊多克隆抗體(Santa Cruz美國)1∶100稀釋，參照試劑盒操作。

1.5 形態(tài)學(xué)測量 每張HE切片中隨機選擇8個視野，應(yīng)用顯微－圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行如下指標(biāo)測量:①肺平均內(nèi)襯間隔(MLI):其數(shù)值反映肺泡平均直徑。②平均泡數(shù)(MAN):其數(shù)值反映肺泡密度。

2 結(jié)果

2.1 模型組豚鼠表現(xiàn) 持續(xù)吸煙2個月后，模型豚鼠較正常組毛發(fā)變黃，呼吸深快，咳嗽，鼻部分泌物較多，飲食及運動情況均較正常組差。

2.2 形態(tài)學(xué)測量結(jié)果 模型組與布地奈德組MLI值明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，反映肺泡平均直徑增大;模型組與布地奈德組MAN值明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，反映肺泡密度減少;布地奈德組較模型組，MLI減低，MAN增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 肺組織MLI、MAN結(jié)果(±s)

表1 肺組織MLI、MAN結(jié)果(±s)

注:*表示與正常對照組比較P＜0.01;#表示與模型組比較P＜0.05

檢測指標(biāo) 正常對照組 COPD模型組模型組 布地奈德組MLI 18.9±1.0 33.6±1.3* 27.4±1.6*#MAN 296.7±18.3 136.3±12.9* 151.2±8.6*#

2.3 MMP-9在肺組織中的表達(dá)結(jié)果 COPD模型組肺組織MMP-9、TIMP-1均較正常對照組有顯著增高(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;布地奈德組MMP-9表達(dá)較模型組顯著下降(P＜0.05)，而TIMP-1無顯著差異。

表2 模型各組與正常對照組肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)結(jié)果(灰度值，±s)

表2 模型各組與正常對照組肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)結(jié)果(灰度值，±s)

注:*與正常組比較P＜0.01;﹟與模型組比較P＜0.05;△正常組比較P＜0.01

MMP-9 TIMP-1正常對照組組別 例數(shù)6 106.7±6.3 114.8±17.4模型組 6 207.3±30.1* 210.1±20.1△布地奈德組 6 164.5±13.0*# 181.0±30.5△

3 討論

COPD是以不完全可逆的氣流受限為特征，由于慢性炎癥作用，表現(xiàn)為氣道損傷、修復(fù)與重塑。本實驗通過被動吸煙制備COPD豚鼠模型，病理形態(tài)學(xué)檢查符合COPD表現(xiàn)，模型復(fù)制成功。以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在氣道壁的降解沉積失衡是COPD不完全可逆氣流受限的重要病理基礎(chǔ)。MMP能降解所有ECM的蛋白成分，包括I型膠原和彈力蛋白。同時具有修復(fù)ECM、促進(jìn)細(xì)胞遷移、分解細(xì)胞因子和激活防御素的作用。過量的MMP可能導(dǎo)致組織損傷。MMP-9屬于MMPS家族的明膠類，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜多種成分。通過一系列基質(zhì)細(xì)胞和COPD發(fā)病機制中重要的兩種炎癥細(xì)胞－中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生。Raulo等［1］對健康的馬與患有COPD馬的支氣管灌洗液中MMP-9比較，發(fā)現(xiàn)COPD組馬的MMP-9明顯高于健康組且與炎性細(xì)胞呈正相關(guān)。得出結(jié)論:MMP-9與COPD的炎癥及呼吸道重塑密切相關(guān)。而TIMP-1是MMP-9天然的抑制劑，通過與MMP-9酶原及活化形式結(jié)合，抑制MMP-9的生物學(xué)效應(yīng)。這兩者均可能參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。本實驗通過香煙熏吸建立豚鼠COPD模型了解MMP-9、TIMP-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)模型組MMP-9、TIMP-1表達(dá)均較正常對照組顯著增多，這與趙華等［2］研究結(jié)果一致。FUNADA 等［3］研究 klotho大鼠，發(fā)現(xiàn)MMP-9表達(dá)增多，而TIMP-1在肺組織中的表達(dá)是減少的。與本實驗結(jié)果不一致，可能與干預(yù)因素不同有關(guān)。同時該實驗發(fā)現(xiàn)klotho大鼠在5周后肺泡腔明顯擴(kuò)大，符合肺氣腫病理表現(xiàn)，但肺泡腔內(nèi)沒有炎性細(xì)胞滲出和間質(zhì)纖維化改變。這與本實驗?zāi)Ｐ筒±肀憩F(xiàn)不一致，模型肺泡腔內(nèi)存在大量的炎性細(xì)胞滲出。這與本實驗通過持續(xù)的被動吸煙引起了氣道慢性炎癥有關(guān)。大量的炎性細(xì)胞滲出，促進(jìn)了TIMP-1表達(dá)增多。表明慢性炎癥的持續(xù)存在刺激了MMP-9、TIMP-1分泌，MMP-9、TIMP-1參與了COPD的發(fā)生發(fā)展。

吸入糖皮質(zhì)激素與COPD的相關(guān)研究已較多，大部分學(xué)者支持吸入糖皮質(zhì)激素在穩(wěn)定期COPD患者中的使用。本實驗欲通過吸入糖皮質(zhì)激素對COPD的干預(yù)，了解激素是否通過對MMP-9和TIMP-1的影響，起到治療作用，從而為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。本實驗結(jié)果顯示，布地奈德干預(yù)COPD模型后MLI減小，MAN增加，肺氣腫有所改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與徐凌等［4］的結(jié)果相似。但實驗中發(fā)現(xiàn)MLI、MAN值與正常對照組仍有顯著差異，表明吸入糖皮質(zhì)激素可以改善氣道和肺組織重構(gòu)，卻不能完全恢復(fù)COPD肺組織病理形態(tài)改變。通過藥物干預(yù)后檢測MMP-9、TIMP-1表達(dá)，布地奈得組MMP-9表達(dá)較模型組有顯著降低(P＜0.05)，而TIMP-1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。推測布地奈德可能通過抗炎作用對MMP-9產(chǎn)生一定影響，使肺組織分泌MMP-9減少，進(jìn)而減少基質(zhì)的過度降解，改善COPD的組織重塑。表明布地奈得通過干預(yù)肺組織中MMP-9的表達(dá)，對COPD起到治療的作用。但布地奈德不能調(diào)控TIMP-1的表達(dá)。

本實驗通過免疫組化的方法檢測，可能存在一定的誤差，并不能準(zhǔn)確反應(yīng)MMP-9、TIMP-1的變化，下一步可以通過分子水平進(jìn)行研究，例如應(yīng)用west blot的方法進(jìn)行蛋白定量分析。希望本實驗的研究對臨床COPD治療應(yīng)用糖皮質(zhì)激素有一定理論支持。

［1］Raulo SM，Sorsa T，Tervahartiala T，et al.MMP-9 as a marker of inflammation in tracheal epithelial lining fluid(TELF)and in bronchial-veolar fluid(BALF)of COPD horses.Equine Vet J，2001，33(2):128-136.

［2］趙華，趙瑾，許西琳，等.COPD大鼠模型氣道MMP-9和TIMP-1表達(dá)的研究.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10(12):2244-2246.

［3］Funada Y，Nishimura Y，Yokoyama M，et al.Imbalance of matrix metalloproteinase-9 and Tissue Inhibit of Matirx metalloproteinase-1 is Associated with Pulmonary Emphysema in Koltho mice.Kobe J Med Sci，2004，50(3-4):59-67.

［4］徐凌，蔡柏薔，朱元玨，等.吸入糖皮質(zhì)激素對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型白細(xì)胞介素-4/干擾素γ和基質(zhì)金屬蛋白酶的影響.中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2004，3(2):86-90.