尖頂羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化作用的研究

潘志福， 蘭 瑛，2， 張 松*

(1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631； 2.深圳市國(guó)想生物科技有限公司，廣東深圳 518114)

尖頂羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化作用的研究

潘志福1， 蘭 瑛1，2， 張 松1*

(1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631； 2.深圳市國(guó)想生物科技有限公司，廣東深圳 518114)

用尖頂羊肚菌胞外多糖提取物檢測(cè)了對(duì)超氧陰離子、羥基自由基及ABTS自由基的抑制作用，用其灌胃衰老模型小鼠，觀察其對(duì)小鼠大腦超氧化物歧化酶活性(SOD)、脂褐素(LF)和丙二醛(MDA)含量的影響.結(jié)果表明：2 mg/mL多糖提取物對(duì)超氧陰離子的抑制率為43.06%，1 mg/mL多糖提取物對(duì)羥基自由基的抑制率為72.40%， 0.1 mg/mL多糖提取物對(duì)ABTS自由基的抑制率為77.43%；50 mg/(kg·d)的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物能使雄性、雌性小鼠腦SOD活性分別提高20.70%、21.13%， LF含量分別降低35.14%、46.93%，MDA含量分別減少15.10%、15.61%.表明尖頂羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的抗氧化和延緩衰老作用，對(duì)雌性小鼠效果略優(yōu)于對(duì)雄性小鼠.

尖頂羊肚菌； 胞外多糖； 抗氧化

尖頂羊肚菌是一種珍稀的食藥用真菌，研究發(fā)現(xiàn)，它有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、降血脂及抗菌等作用，具有重要的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值[1-4].多糖是其主要的活性物質(zhì)，然而關(guān)于尖頂羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化和延緩衰老的研究尚不多見(jiàn).本研究通過(guò)液體培養(yǎng)獲得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物，檢測(cè)其對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基及ABTS自由基的抑制作用，研究其體外抗氧化活性，并將尖頂羊肚菌胞外多糖提取物灌胃衰老模型小鼠，觀察其對(duì)小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、脂褐素(LF)、丙二醛(MDA)等的影響來(lái)研究其抗氧化作用，為認(rèn)識(shí)其作用機(jī)制和開(kāi)發(fā)健康食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試菌種 尖頂羊肚菌(Morchellaconica)，由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g由中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度24～26 ℃，許可證號(hào)：SCXK(粵)2004-0011.

1.1.3 主要試劑 2,2聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、抗超氧陰離子試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒、LF試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；D-半乳糖購(gòu)自上海伯奧生物科技有限公司；維生素E購(gòu)自廣州星群(藥業(yè))股份公司.

1.2方法

1.2.1 尖頂羊肚菌胞外多糖的提取 將尖頂羊肚菌接種到液體培養(yǎng)基(葡萄糖50 g、NH4NO32 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、維生素B10.1 g,蒸餾水定容至1 L，pH調(diào)至6.5)，26 ℃、180 r/min培養(yǎng)10 d，收集培養(yǎng)液，濃縮，Sevag法去蛋白，加95%乙醇沉淀，將沉淀物真空冷凍干燥,獲得尖頂羊肚菌胞外多糖提取物[5](簡(jiǎn)稱多糖提取物，下同). 其主要成分為：總糖含量59.40%；蛋白質(zhì)含量7.88%.

1.2.2 多糖提取物對(duì)超氧陰離子自由基的抑制作用 模擬機(jī)體中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基，測(cè)定多糖提取物對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率，測(cè)定的具體方法參照抗超氧陰離子試劑盒說(shuō)明書(shū).

1.2.3 多糖提取物對(duì)羥基自由基的抑制作用 參照柳紅[6]的方法，利用鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系測(cè)定提取物對(duì)羥基自由基的抑制率.

1.2.4 多糖提取物對(duì)ABTS自由基抑制作用 按照文獻(xiàn)[7-8]的方法并稍加改進(jìn)，測(cè)定多糖提取物對(duì)ABTS自由基的抑制率.

1.2.5 小鼠生理生化實(shí)驗(yàn) 將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、造模組、陽(yáng)性對(duì)照組、多糖提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組共6個(gè)組，每組10 只，雌雄各半，自由進(jìn)食和飲水，造模組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組每天腹腔注射劑量為120 mg/(kg·d)的D-半乳糖溶液0.2 mL，空白對(duì)照組注射等量的生理鹽水，連續(xù)注射42天.低、中、高劑量組分別灌胃尖頂羊肚菌多糖提取物為50、200、800 mg/(kg·d)，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃量為800 mg/(kg·d)的維生素E，空白對(duì)照組和造模組分別灌胃生理鹽水，各組小鼠的灌胃量均為0.2 mL，連續(xù)灌胃42天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頸法取腦，在超聲波細(xì)胞粉碎儀制成大腦勻漿，離心后，取上清液，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定小鼠的SOD活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，熒光比色法測(cè)定LF含量，測(cè)定的具體方法均參照試劑盒說(shuō)明書(shū). 數(shù)據(jù)采用DPS 3.01 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用LSD(least significant difference)法(最小顯著性差異法)進(jìn)行方差分析.

1.2.6 肝臟切片組織的觀察 取出小鼠肝臟，體積分?jǐn)?shù)10%的福爾馬林溶液保存，按常規(guī)石蠟切片制作方法，梯度乙醇脫水處理、石蠟包埋、二甲苯脫蠟，伊紅-蘇木素染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟切片的組織形態(tài).

2 結(jié)果與分析

2.1多糖提取物對(duì)超氧陰離子自由基的抑制作用

多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力以抑制率表示，抑制率越高，說(shuō)明多糖抗氧化作用越強(qiáng).圖1可見(jiàn)，低質(zhì)量濃度時(shí)，維生素C(Vc)對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率較高，隨質(zhì)量濃度的增大，多糖提取物和Vc二者對(duì)超氧陰離子自由基抑制效果接近.達(dá)到2 mg/mL時(shí)，多糖提取物的抑制率為43.06%，這表明多糖提取物對(duì)超氧陰離子自由基具有一定的抑制作用，且抑制效率與多糖提取物質(zhì)量濃度呈正相關(guān).

圖1 尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)超氧陰離子自由基的抑制作用

Figure 1 Inhibition of the exopolysaccharide extract fromM.conicaon uperoxide anion

2.2多糖提取物對(duì)羥基自由基的抑制作用

圖2顯示，多糖提取物和Vc均具有抑制羥基自由基的能力，它們的抑制能力均與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān).抑制率為50%對(duì)應(yīng)的提取物質(zhì)量濃度為0.81 mg/mL;當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)羥基自由基的抑制率為72.4%.這表明多糖提取物對(duì)羥基自由基具有一定的抑制能力.

圖2 尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)羥基自由基的抑制作用

Figure 2 Inhibition of the exopolysaccharide extract fromM.conicaon hydroxyl radical

2.3多糖提取物對(duì)ABTS自由基的抑制作用

圖3顯示多糖提取物對(duì)ABTS自由基具有較好的抑制作用，隨著多糖提取物質(zhì)量濃度的增加，對(duì)ABTS自由基的抑制能力逐漸加強(qiáng)，當(dāng)抑制率為50%時(shí)，分別對(duì)應(yīng)的多糖提取物質(zhì)量濃度為0.026 mg/mL、Vc 質(zhì)量濃度為0.027 mg/mL.當(dāng)質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)ABTS自由基的抑制率為77.43%.說(shuō)明多糖提取物對(duì)ABTS自由基有較強(qiáng)的抑制能力.

圖3 尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)ABTS自由基的抑制作用

Figure 3 Inhibition of the exopolysaccharide extract fromM.conicaon ABTS radical

2.4多糖提取物對(duì)小鼠腦SOD活性、LF和MDA的影響

從表1可知，多糖提取物在50 mg/(kg·d)的劑量下使雄性小鼠腦SOD活性提高20.70%(P<0.01),腦LF含量降低35.14%(P<0.01)，腦MDA含量降低15.10%；其對(duì)雌性小鼠腦SOD活性提高21.13%(P<0.05)，腦LF含量降低46.93%(P<0.01)，腦MDA含量降低15.61%(P<0.05)，小鼠SOD活性比陽(yáng)性對(duì)照組高， LF含量比陽(yáng)性對(duì)照組低.

200 mg/(kg·d)多糖提取物能使雄性小鼠腦LF含量降低24.32%(P<0.01)，MDA含量降低18.68%；其使雌性小鼠腦LF含量、MDA含量分別降低45.91%(P<0.01)、19.41%(P<0.05)，但是對(duì)雄性和雌性小鼠腦SOD活性均與模型組沒(méi)有顯著差異.

800 mg/(kg·d)的多糖提取物能使雄性小鼠腦LF含量降低29.73%(P<0.01)，MDA含量降低19.13%(P<0.05)，腦SOD活性則比模型組降低13.20%，但沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；其能使雌性小鼠腦LF含量、MDA含量分別降低32.65%(P<0.01)、23.07%(P<0.05)，使腦SOD活性提高了18.02%(P<0.05).

圖4表明，通過(guò)與模型組比較,多糖提取物對(duì)小鼠的LF影響最大，本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的3個(gè)劑量組中，50 mg/(kg·d)(低劑量組)使LF含量增加優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，且具有性別的差異，對(duì)雌性小鼠的LF作用略優(yōu)于對(duì)雄性小鼠的作用.

Y軸表示各組與模型組比較，SOD活性增加的百分比以及LF、MDA減少的百分比.

圖4 不同劑量的尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)雌雄小鼠SOD、LF和MDA影響的比較

Figure 4 Comparison on the exopolysaccharide extract fromMorchellaconicaPers with diversed dosages affecting SOD, LF and MDA of male and female mice

表1 尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)小鼠腦SOD活性、LF、MDA的影響Table 1 Effects of the exopolysaccharide extract from Morchella conica Pers on SOD，LF，MDA in mice brain(±s)

注:與模型組比較，*:P<0.05;**:P<0.01.

2.5小鼠肝臟切片的組織形態(tài)

模型組雄性小鼠肝組織切片(圖5a)中細(xì)胞核凝聚，細(xì)胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞呈現(xiàn)干枯狀，表現(xiàn)出衰老狀態(tài)；50 mg/(kg·d)(低劑量組)多糖提取物灌胃的雄性小鼠肝組織切片(圖5b)邊界清晰，細(xì)胞形態(tài)較為正常.

3 討論

衰老是生物界的普遍現(xiàn)象,一般與體內(nèi)自由基含量有關(guān).細(xì)胞組織受到自由基攻擊后，生物大分子發(fā)生變形、斷裂，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老[9]. 羥基自由基及超氧陰離子等自由基引發(fā)的體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化是機(jī)體衰老的重要原因[10].本研究發(fā)現(xiàn)，尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基具有抑制作用，并呈一定的量效關(guān)系.這表明尖頂羊肚菌胞外多糖提取物具有清除自由基，阻斷自由基反應(yīng)鏈，降低自由基對(duì)機(jī)體組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物大分子的損害作用.

圖5 雄性小鼠肝臟組織的切片

機(jī)體存在多種抗氧化物酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶等具有相互協(xié)調(diào)作用來(lái)清除自由基[9].超氧化物歧化酶能有效清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用，MDA是自由基攻擊機(jī)體組織導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，而LF是機(jī)體老化的代謝產(chǎn)物，能反映其氧化損傷的程度.食藥用菌多糖能降低過(guò)氧化脂質(zhì)含量、提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力[11].牛肝菌胞外多糖能有效清除超氧陰離子自由基和抑制羥基自由基產(chǎn)生，減少小鼠肝組織MDA含量[12].櫟金錢菌活性提取物通過(guò)提高衰老模型小鼠血清SOD活性、減少肝MDA含量和LF含量，具有良好的抗氧化和延緩衰老效果[13].本研究發(fā)現(xiàn)，50 mg/kg·d尖頂羊肚菌胞外多糖提取物能提高雌性小鼠SOD活性21.13%，降低LF含量46.93%和MDA含量15.61%.表明尖頂羊肚菌胞外多糖提取物可提高SOD活性，抑制了體內(nèi)羥基自由基、超氧陰離子等自由基，保護(hù)機(jī)體組織免受自由基損傷，減少了丙二醛、脂褐素等衰老產(chǎn)物，從而延緩機(jī)體衰老.

食藥用菌活性提取物抗氧化與延緩衰老的效果有性別差異.櫟金錢菌活性提取物對(duì)雄性小鼠的抗衰老效果比雌性好[13].本研究發(fā)現(xiàn)尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)雌性小鼠的延緩衰老效果要略優(yōu)于對(duì)雄性小鼠.這可能與尖頂羊肚菌胞外多糖提取物調(diào)節(jié)雌性激素及類似物有關(guān)，因?yàn)榇菩约に乜梢源龠M(jìn)抗衰老基因的表達(dá)，減少體內(nèi)自由基產(chǎn)生，某些雌性激素類似物還具有延壽的效果[14].

尖頂羊肚菌胞外多糖提取物是一種無(wú)毒具有開(kāi)發(fā)潛力的天然抗氧化劑資源，它能有效提高腦SOD活性，降低腦LF和MDA含量，抑制羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基，具有良好的抗氧化效果.

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Keywords：Morchellaconica; exopolysaccharide; superoxide radical; hydroxyl anion radical; ABTS free radical; antioxidant; antiaging

【責(zé)任編輯 成 文】

STUDYONTHEANTIOXIDATIVEANDANTIAGINGEFFECTSOFTHEEXOPOLYSACCHARIDEEXTRACTFROMMORCHELLACONICA

PAN Zhifu1, LAN Ying1，2, ZHANG Song1*

(1.School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China，
2.Guoxiang Biological Science and Technology Co,Ltd., Shenzhen 518114, China)

Inhibitions of the exopolysaccharide extract fromMorchellaconicaon superoxide anion, hydroxyl radical and ABTS free radical were tested for evaluating the in-vitro-antioxidant activity. And through gastric perfusion to aging model mice, effects of the extract on superoxide dismutase activity, content of malondialdehyde and lipofuscin in brains of mice were studied. The results showed that the exopolysaccharide extract inhibited superoxide anion by 43.06% at 2 mg/mL, scavenged hydroxyl radical by 72.4% at 1 mg/mL and ABTS free radical by 77.43% at 0.1 mg/mL. And at 50 mg/(kg·d) of the extract, SOD activities of male and female mice were increased by 20.70% and 21.13% respectively, while contents of LF and MDA were decreased 35.14% and 46.93%, 15.10% and 15.61%. It suggests that the exopolysaccharide extract fromM.conicahas obviously antioxidative and antiaging effects,and had gender differences on the antiaging effects, expressing a superior effect on female mice.

2010-09-19

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007Z3-E0421)；廣東省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2009B090300298)；華南師范大學(xué)國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(091057425).

*通訊作者,zhangs@scnu.edu.cn

1000-5463(2011)02-0124-05

S646

A